המטרה הכוללת של טכניקות אלה היא להעריך את הפתופיזיולוגיה הרשתית במודל חולדת רטינופתיה סוכרתית הנגרמת על ידי סטרפטוזוטוצין. רטינופתיה סוכרתית היא אחת הגורם המוביל לעיוורון. החיפוש המתמשך נמשך כדי לגלות סוכנים פרמקולוגיים עם יעילות טובה יותר ופעולה ארוכה יותר לטיפול רטינופתיה סוכרתית.
התהליך של גילוי סוכנים פרמקולוגיים במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים ממלא תפקיד חיוני. מודלים אלה של בעלי חיים מסייעים להבין את השינויים המבניים והתפקודיים של רקמות המקטע האחורי של העין. לכן, אנחנו נפגין שלוש טכניקות שונות כדי ללמוד את השינויים האלה בסוגיות המגזר האחורי.
אנו מדגימים היסטולוגיה כדי לחקור שינויים מורפולוגיים של תאי רשתית בשכבות, בדיקת פירוק BRB כדי לחקור BRB נפגע על ידי כימות חלבון דלף בזגוגית מפלזמה, וגם אנגיוגרפיה פלואורסצ'ה לדמיין כלי רשתית באמצעות צבע FITC-dextran. המתת חסד חולדה באמצעות מינון גבוה של pentobarbital ולאשר את מותו ללא פעימות לב לגילוי. Enucleate העין על ידי ביצוע חתכים באמצעות להב אזמל על האף ואזורי הזמן של העין.
ואז לחתוך לאורך הקצוות שלה כדי להסיר את העין משקע מסלולית. הסר את עודף השומן המקיף את העין ומניחים אותו ב 5 מ"ל של פתרון קבוע. לדגור על העין בתמיסה קבועה במשך 24 עד 48 שעות.
לאחר קיבעון, להסיר את העין מן הפתרון הקבוע ולהעביר צלחת פטרי מלא 10 מ"ל PBS. באמצעות מיקרו מלקחיים, להחזיק את העין עם עצב הראייה ולעשות ניק ב pars פלאנה בעזרת מספריים מיקרו. חותכים את כל השוליים של הקרנית כדי להפריד את הכוס הקדמית ואת העין האחורית.
הסר את העדשה ולחתוך את עצב הראייה. חותכים את הכוס האחורית לשני חצאים, עובר דרך עצב הראייה. מעבירים כל חצי לקלטות הנפרדות.
לייבש את הרקמה על ידי הגדלת בהדרגה את הריכוז של אתנול מ 50% ל 100% אתנול. ולבסוף, לנקות את האתנול עם קסילן. להפרות את הרקמה עם פרפין מחומם מראש ב 60 מעלות צלזיוס להחליף קסילן ברקמה.
הכן את בלוקי הפרפין באמצעות תבנית פלדה להחזיק את הרקמה ואת הקלטת כבסיס שלה. בעת הכנת הבלוק, חלק הדיסק האופטי של העין צריך להתמודד עם החלק התחתון של עובש פלדה. ממלאים את הקסטה בפרפין ומעבירים אותה למשטח קריר.
הר את הלהב והקלטת על המחזיקים המתאימים על מיקרוטום. בעזרת מיקרוטומיה, חותכים את שעוות הפרפין העודפת וחותכים סרט של חמישה עד שישה חלקים בעובי של 5 מיקרומטר. העבר את הסרט אל פני השטח של אמבט מים שחומם מראש כדי לפתוח את הסרט.
לאסוף את החלקים על שקופית זכוכית מצופה אלבומין. אפשר את השקופיות להתייבש לילה ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לבצע כתמי המטוקסילין ואאוזין, מחממים מראש את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי להמיס את הפרפין.
בצע את הליך ההכתמה כפי שניתן בכתב היד. התחל עם rehydration של רקמות, ולאחר מכן כתם עם המטוקסילין ואחריו אאוזין. עכשיו, לייבש את הרקמה ולהוסיף מדיום הרכבה על החלקים.
מניחים את תלוש הכיסוי על מקטעים ומדמיינים תחת מיקרוסקופ אור. כדי לבצע בדיקת פירוק מחסום רשתית דם, להרדים את החולדה באמצעות קטמין וקסילאזין ולאשר את מצב ההרדמה על ידי צביטת בוהן. אתר את הלב והכנס מזרק 1 מ"ל עם מחט 24-מד כדי לצייר את הדם על ידי ניקוב לב.
לאחר איסוף הדם המספיק, העבר אותו לצינור מצופה EDTA. מערבבים אותו בעדינות כדי למנוע המוליזה. עורר את העין והעבר אותה מיד לקרח יבש.
בתנאים קפואים, להתחיל את הניתוח של העין על ידי הסרת הקרנית והעדשה. משוך את הזגוגית מן החלק האחורי של העין באמצעות מלקחיים ללא כל זיהום מרשתית. העבר אותו לצינור הומוגני עם שלושה עד ארבעה חרוזים.
הומוגניזציה הדגימות באמצעות הומוגניזר חרוזים במהירות בינונית במשך 10 שניות. העבר דם ודגימות הומור זגוגיות לתוך צינורות microcentrifuge כדי לעבד עוד יותר. צנטריפוגה שתי הדגימות ב 5, 200 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
בעזרת פיפטה רב ערוצית, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של ריאגנט ברדפורד לבארות. לדלל דגימות זגוגית 10 פעמים ודגימות פלזמה 20 פעמים באמצעות PBS. מוסיפים 5 מיקרוליטרים של דגימות מדוללות לריגנט ברדפורד ומערבבים היטב.
לדגור על הדגימות במשך 20 עד 30 דקות, ולאחר מכן למדוד את הספיגה ב 590 ננומטר באמצעות קורא צלחת 96-well. עוצמת המדגם היא פרופורציונלית ישירות לריכוז החלבון. כדי לבצע אנגיוגרפיה פלואורסצנטית, להרדים את החולדה באמצעות 3% איזופלוריין ולאשר את מצב ההרדמה על ידי אגרוף הבוהן.
טובלים את הזנב במים חמים לפני הזרקת הצבע. להזריק 1 מ"ל של 50 מ"ג לכל mL FITC-dextran פתרון לתוך וריד זנב לרוחב. אפשר את הצבע להסתובב במשך 5 עד 10 דקות.
להרדים את החולדה באמצעות pentobarbital ולאשר את מותו על ידי פעימות לב לגילוי. לעטוף את העין ולהמשיך להכנת הרכבה שטוחה. כדי להכין הרכבה שטוחה ברשתית, מניחים את העין על קימוויפה ללא סיבים וחותכים את החלק הקדמי של העין.
משכו באיטיות את העדשה, יחד עם ההומור הזגוגי, מהחלק האחורי של העין. מעבירים את החלק האחורי לצלחת פטרי מלאה ב- PBS וחותכים את עצב הראייה. עכשיו, למקם את קצה המלקחיים המחודדים בין סקלרה ורשתית.
הזיזו אותו בעדינות לאורך כל שפת הכוס כדי לוודא שהרשתית אינה מחוברת לסקלרה בשום שלב. חותכים ליד הדיסק האופטי, כך שהרשתית מתנתקת לחלוטין מהסקלרה. ברגע שהוא אישר כי רשתית אינה מחוברת sclera מכל צד, לדחוף אותו לאט לתוך פתרון PBS.
בעזרת מלקחיים, מעבירים את הרשתית למגלשת זכוכית נקייה מבלי לגרום לה נזק. באמצעות מיקרו מספריים או להב אזמל, לעשות ארבעה חתכים על הרשתית, כפי שמוצג, כדי לחלק אותו לארבעה רבעים. הסר PBS עודף מסביבת הרשתית והוסף מדיום הרכבה אנטי דהייה על הרכבה שטוחה ברשתית.
לכסות אותו עם כיסוי ולדמיין את ההרכבה השטוחה תחת מיקרוסקופ קונפוקל. חשוב לציין כאן כי כל התהליך של אנגיוגרפיה פלואורסצנטית מבוצע תחת אור מינימלי כדי למנוע את מרווה של פלואורסצנטיות מצבע FITC-dextran. בחולדה סוכרתית, תאי הרשתית עוברים ניוון, מה שמוביל לסיבוכים נוספים.
שינויים מבניים אלה ניתן לדמיין על ידי טכניקה היסטולוגית כדי לקבוע את מספר התא ואת עובי הרשתית. במקרה של חולדות סוכרתיות, עובי שכבות הרשתית עולה עקב בצקת. לפיכך, טכניקה זו מסייעת לסנן סוכנים פרמקולוגיים פוטנציאליים שונים לטיפול רטינופתיה סוכרתית.
שינויים מטבוליים ברשתית עקב סוכרת גורם לאובדן של pericytes ופירוק של מחסום רשתית הדם. כפי שיש דליפה של חלבון וביומולקולות אחרות לתוך רשתית וזגוגית, רמות החלבון הכולל להגדיל את הזגוגית של חולדות סוכרת. מניעת פירוק של מחסום רשתית הדם עלולה לעכב באופן משמעותי את ההתקדמות של רטינופתיה סוכרתית.
ברטינופתיה סוכרתית, ביטוי של גורם גדילה אנדותל כלי דם מגביר שמוביל להיווצרות של כלי חדשים. כלי דם אלה מפריעים למבנה הרשתית הרגיל, ולכן innervation שלה הוא של דאגה עיקרית לטיפול רטינופתיה סוכרתית. טכניקת אנגיוגרפיה פלואורסצנטית משמשת כדי לדמיין כלי דם חדשים וגם דליפה של כלי דם, כפי שמודגש כאן.
עם זאת, אנגיוגנזה בולטת רק לאחר שישה עד 12 חודשים של אינדוקציה סוכרת. טכניקה זו מסייעת לנו לכמת את ההשפעה של טיפול תרופתי על innervation של אנגיוגנזה ודליפת כלי דם. הטיפול העתידי של רטינופתיה סוכרתית צריך סוכנים פרמקולוגיים יעילים יותר, אבל הטיפולים העתידיים יכולים להיות מושגים רק באמצעות הבנה טובה יותר של המחלה פתוגנזה.
שליטה בטכניקות אלה יכולה לעזור לחוקרים לקבל הבנה טובה יותר על פתוגנזה של רטינופתיה סוכרתית, אשר יכול להוביל לגילוי של התערבויות פרמקולוגיות טובות יותר.
