הפרוטוקול מאפשר לנו לדמיין את השינויים בארגון מחדש השני של DNA המושרה על ידי חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP. השינוי במבנה הדנ"א יכול להיות מתואם לרגולציית התמלול. זוהי טכניקה קלה ורגישה מאוד המשתמשת בכמות קטנה מאוד של DNA טהור כדי לתעד את השינויים המבניים באוליגונוקלאוטיד.
שיטה זו יכולה לספק תובנה על ויסות שעתוק בתיווך חלבוני שיפוץ כרומטין תלויי ATP. כדי להתחיל, להכין את ריכוזי העבודה של חוצצים ורכיבי תגובה אחרים טרי ולשמור אותם בארבע מעלות צלזיוס לפני הגדרת התגובות, ולאחר מכן למדוד את פעילות ATPase של החלבון בנוכחות מולקולות DNA שונות באמצעות NADH מצמיד בדיקת חמצון. מערבבים ADAAD 0.1 מילימולר, ATP שני מילימולרים, 10 ננומולר DNA, ו 1X REG חוצץ בצלחת 96 טוב לנפח סופי של 250 microliters.
לאחר מכן, לדגור על התגובה במשך 30 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן למדוד את כמות NAD + באמצעות התוכנה המסופקת יחד עם קורא microplate. כדי למדוד את הספיגה ב 340 ננומטר, לחץ על ת.ד. את naDH assay ומניח את צלחת 96-well על מחזיק הצלחת במכשיר, ולאחר מכן לחץ על כפתור לוח הקריאה כדי להקליט את הספיגה. אסוף את ספקטרום התקליטור בקובטות קוורץ בשקיפות גבוהה.
השתמש בקובטים מלבניים או גליליים. כדי לנקות את cuvettes, לשטוף אותם עם מים מספר פעמים, ולאחר מכן לקחת סריקה של המים או חוצץ cuvette כדי לבדוק אם זה נקי. לתגובות, השתמש באוליגונוקלאוטידים מטוהרים בדנ"א.
לקירור מהיר, מחממים את הדנ"א ב-94 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות על בלוק החימום ומקררים אותו מיד על קרח. לקירור איטי, לאחר חימום ה- DNA ב 94 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות, אפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר בקצב של מעלה אחת צלזיוס לדקה. כדי להקליט את הספקטרום הבסיסי, להגדיר בסך הכל חמש תגובות בקרה אחד אחד בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר.
שמור את נפח התגובה על 300 מיקרוליטרים בכל התגובות. כדי להקליט את ספקטרום התקליטור, להגדיר בסך הכל חמש תגובות ניסיוניות אחד אחד בצינורות צנטריפוגות 1.5 מיליליטר. כדי להקליט את הסריקה, הפעל את הגז והפעל את ספקטרומטר התקליטור.
לאחר 10 עד 15 דקות, להפעיל את המנורה, להפעיל את אמבט המים ולהגדיר את טמפרטורת המחזיק על 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, פתח את תוכנת ספקטרום התקליטורים והגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס, את טווח אורך הגל ב-180 עד 300 ננומטר, את הזמן לנקודה ל-0.5 שניות ואת מספר הסריקה לחמש, ואז לחץ על מציג הנתונים המקצועי, צור קובץ חדש ושנה את שמו לפרטי הניסוי והתאריך. לאחר מכן, מערבבים את התגובות הבסיסיות והניסוי על ידי צנרת ומעבירים בזהירות את תערובות התגובה בזה אחר זה לקובט, ומבטיחים שאין בועות אוויר.
אם מבצעים ניסוי בקורס זמן, לדגור את התגובות ב 37 מעלות צלזיוס לזמן הנדרש, ואז לקחת את הסריקה. הוסיפו את EDTA למאגר המכיל את הדנ"א, ה-ATP, המגנזיום והחלבון כדי לעצור הידרוליזה של ATP. כדי לעכב לחלוטין את פעילות ATPase, להגדיל את ריכוז EDTA וזמן הדגירה.
הפחת את קווי הבסיס מהתגובות המתאימות בתוכנה והחליק את הנתונים בתוכנת ספקטרום התקליטורים או בתוכנת התוויית הנתונים, ולאחר מכן התווה גרף של אורך גל כנגד אליפטיות שאריות ממוצעת וניתח את הפסגות. קפלי M הראו כי שני גדילי ה- DNA MYC יכולים ליצור מבנה דמוי לולאת גזע. המבנים המקפלים M של רצף ה- DNA הקדמי וההפוך המכיל את G quadruplex GECE מוצגים כאן.
ספקטרום התקליטור של GECE מקורר במהירות בהיעדר ונוכחות של ATP ו ADAAD הראה כי ADAAD גורמת שתי פסגות חיוביות, אחד ב 258 ננומטר והשני ב 210 ננומטר. התוספת של EDTA שוללת שינוי קונפורמציה זה. ספקטרום התקליטורים יש עכשיו שיא שלילי 210 ננומטר ופס חיובי רחב עם פסגות ב 230 ו 250 ננומטר.
ממפה QGRS וניתוח קיפול M הראו כי אזורי האמרגן של DROSHA, DGCR8 ו- DICER הם בעלי פוטנציאל ליצור G מרובע ומבנים דמויי גזע. ספקטרום התקליטורים של זוג DROSHA חמש הראה כי ADAAD גרים שיא שלילי ב 210 ננומטר ושיא חיובי ב 260 ננומטר. ספקטרום זה הוא מאפיין של ADNA.
ספקטרום התקליטורים של זוג DGCR8 אחד הראה שיא חיובי ב 210 ננומטר ושיא שלילי רחב ב 260 ננומטר. ספקטרום זה אופייני למעבר B עד X. עבור זוג DGCR8 שבע, שיאים חיוביים חזקים ב 210 ו 270 ננומטר ושיא שלילי ב 250 ננומטרים נראו.
ספקטרום זה אופייני למבני דנ"א מקבילים של G מרובע. לבסוף, עבור זוג DICER אחד, שיא חיובי ב 210 ננומטר ושתי פסגות שליליות, אחד ב 230 ננומטר והשני ב 260 ננומטר נצפו. פסגות אלה אופייניות למעבר A עד X DNA.
ודא כי טוהר ה- DNA והחלבון הוא 99% או יותר. cuvette צריך להיות נקי ואת הבסיס צריך להיות פחות מ millidegree אחד. כל הריאגנטים צריכים להיות טהורים כך שהרקע הוא פחות ממילימטר אחד.
