המטרה הכוללת של מאמר השיטה הבאה היא להדגים פרוטוקול שימושי כדי ללמוד אינטראקציות RNA עם חלבונים או גורמים אחרים באמצעות פינצטה אופטית בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. בעשור האחרון פותחו מספר טכניקות מתוחכמות כדי לחקור את המאפיינים של מקרומולקולים בודדים. אחת הטכניקות האלה היא פינצטה אופטית של מולקולה אחת.
עם פינצטה אופטית חדשה בסיוע פלואורסצנטיות, לא רק כוחות הנדרשים להתפתחות של מולקולות RNA, כמו גם אירועים מחייבים במהלך התרגום ניתן לפקח בפירוט. כאן אנו מתמקדים במדידות שבהן מולקולות RNA נמתחות עם ובלי גורמי טרנספרציה המסדירים את התרגום. אנו גם ממחישים כיצד ניתן ליישם את הטכניקה לניטור התרגום באמצעות ריבוזומים המסומנים בתווית.
הפרוטוקול יודגם על ידי שני סטודנטים לתארים מתקדמים בקבוצה שלי, לוקאס פקארק וסטפן פארק. בסרטון זה, אנחנו הולכים להנחות אותך דרך ההתקנה והביצוע של ניסוי פינצטה אופטית. אנו גם מתארים את זרימת העבודה הפשוטה של ניתוח נתונים.
היתרון של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה וחזקה. מולקולה קשורה בין שני חרוזים, קשורה במוקד קרני לייזר, ושינוי וכוח בעת תזוזה ניתן למדוד במדויק במה שמכונה ניסויים ברמפה כוח. מבנים משניים בתוך חבל נפרשים בכוח מסוים בהתאם לאנרגיה הפנימית של המולקולה.
מעבר דינמי זה בין מבנים מרובים ניתן לחקור עוד יותר עם מדידות כוח קבועות. יתר על כן, השימוש המקביל של הדמיה פלואורסצנטית יכול לשמש כדי לדמיין אירועים מחייבים בזמן אמת. פרופיל ברור של מרחק כוח של קשר עשוי להשתנות לאחר כריכת גורמי טרנספרציה פוטנציאליים המשפיעים על יציבותו.
ראשית, הרנ"א של עניין צריך להיות משובט לתוך וקטור DNA. במעלה ובמורד הזרם של רצף זה, חלקים נוספים, הידיות נדרשות כדי לקשור את מבנה ה- DNA-RNA הסופי בין החרוזים. לאחר שיבוט מוצלח והגברה של plasmid, שלוש תגובות PCR שונות מבוצעות.
עבור כל תגובת PCR, מערבבים את הריאגנטים לפי טבלה אחת בפרוטוקול. הפעל את ה- PCR ב-50 עליקוטים מיקרוליטרים ברכב אופניים תרמי מתאים. הראשון גורם לדנ"א כפול של כל המבנה עם מקדם T7 לתמלול במבחנה שלאחר מכן.
ה-PCR השני מייצר את חמש הידיות הראשיות. בעוד שהתגובה האחרונה גורמת לשלוש הידיות העיקריות. יש לתייג הן את 5 נקודות הפריים והן את 3 ידיות הפריים לפי החרוזים המשומשים.
שלוש נקודות האחיזה העיקריות מסומנות במהלך ה-PCR באמצעות פריימר הפוך עם תווית דיגוקסיגנין, ויש לתייג את חמש הידיות העיקריות בשלב נוסף באמצעות ביו-טינילציה. שלוש הביוטילציה העיקרית של חמש הידיות העיקריות מבוצעת באמצעות T 40 ופולימראז. התגובה מתבצעת במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לבצע את תמלול אין ויטרו באמצעות T7 פולימראז. לדגור על התגובה ב 37 מעלות במשך שעתיים עד ארבע שעות, בהתאם לאורך הרנ"א. בשלב אחד אחרון, הידיות מחושלות עם ה- RNA מהתעתיק במבחנה כדי להשיג את מבנה ה- DNA-RNA הסופי עם אזור העניין התקוע היחיד בין הידיות התקועות הכפולות.
כדי לטל את היברידית ה-RNA-DNA הרצויה, מערבבים את הידיות ואת הרנ"א במאגר חישול. מחממים, תערובת חישול עד 85 מעלות במשך 10 דקות, ולאחר מכן לאט לאט לקרר את המדגם לארבע מעלות. מערבבים את המדגם המחושג עם 1/10 של נפח של שלושה אצטט נתרן טוחן, ושלושה כרכים של אתנול קר קרח ודגרה מינוס 80 מעלות במשך שעה לפחות.
צנטריפוגה הדגימות ב 15, 000 xg במשך 30 דקות בארבע מעלות. להשליך את supernatant ולייבש את הכדור תחת ואקום. עליקוטים קטנים של הכדור resuspended קפואים בחנקן נוזלי נשמרים במינוס 80 מעלות עד שהם משמשים.
ראשית להסיר את המלבין מתוך המזרקים ולמלא mL אחד של מים חינם RNase. מוסיפים 50 מיקרוליטר של נתרן טוחן 0.5 תיוסולפט ושטפו את המערכת עם מוט אחד. היזהר כי המערכת microfluidic אף פעם לא פועל יבש כדי למנוע בועות אוויר במערכת.
לאחר מכן, להשליך את פתרון נתרן thiosulfate הנותר ולהחליף את המזרקים עם חדשים. ואז לשטוף שוב עם לפחות 0.5 מ"ל של מים חינם RNase. כדי להגדיר את המערכת האופטית של המכונה, לשים שתי טיפות של שמן טבילה על המטרה.
שים את תא הזרימה במקום ולהעלות את המטרה עד הנוזל נוגע בתא הזרימה. ואז לשים שתי טיפות של שמן טבילה על גבי תא הזרימה. עכשיו להפעיל את יחידת היגוי מלכודת ולייזר הלכיד.
המטרה מותאמת באמצעות כלי איתור Z של מצלמות האבחון של המכונה. על ידי סיבוב בורג המיקרו, ציר Z מותאם לאמצע התא בין ההשתקפות השנייה והשלישית. היכן שטבעות השחלה הן הגדולות ביותר.
מעבירים את מצלמות האבחון למצב ירח ומפחיתים את לייזר ההשמנה לסביבות 50%ואז מורידים את המעבה ומתאימים את מיקומו כך שתראו כ-10 רצועות אור. לתא המדידה יש חמישה ערוצים, ולפני הניסוי יש לשקול אפשרויות התקנה שונות. לניסוי פשוט של רמפה כוח, חרוזים-חוצץ-חרוזי הוא סידור ערוצים נוח.
עבור מדידות עם המתחם הרביעי, כמו ריבוזומים פלואורסצנטיים או גורמי טרנספר, גורם חרוזים-חרוזים-חוצץ הוא סידור טוב יותר, אבל זה מקשה על לתפוס חרוזים. aliquot של מבנה חישול הוא דגירה עם שלושה השעיית חרוזים MICROLITER AD, מעכבי RNase microliter אחד, ושמונה microliter של חוצץ בדיקת בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 20 דקות. לאחר מכן המדגם מדולל ב-500 מיקרו-ליטר, ובחצץ.
עבור הסוג השני של חרוזים, 0.8 microliter של חרוזי אסאי מעורבבים עם mL אחד של חוצץ אסאי ומנוהל לתוך הערוץ המתאים. הערוצים נפתחים ונשטפים בלחץ נמוך. עכשיו תדליק את לייזר ההשמנה.
כדי לתפוס חרוזים, הלייזרים מופרדים זה מזה וחרוז AD נתפס במלכודת אחת. בשלב הבא הבמה מועברת לערוץ חרוז SA וחרוז נתפס במלכודת 2. כדי להימנע מאובדן החרוזים, או כדי לתפוס שני באותה מלכודת, הבמה מועברת לערוץ המאגר וכל הערוצים סגורים.
במאגר מתבצע כיול השמנה. יש להגדיר את החרוזים שנתפסו כתבניות חזותיות עבור המדידות הבאות. וציון הדמיון צריך להישמר מעל 90% בין מדידות כדי להבטיח השוואתיות.
לבסוף, החרוזים מועברים קרוב יותר זה לזה ואפשר להתחיל לתפוס קשר אחד. זה נעשה הזזת החרוזים קרוב במשך כמה שניות ולאחר מכן לאט לאט לעזוב את החרוזים שוב. היווצרות קשירה גורמת לעלייה של כוח מדוד על משיכת שני החרוזים אחד מהשני.
ניתן לבדוק את מספר ואיכות הצמיגים על ידי מציאת הרמה המתוחה ולהשוות את המסלול עם השרשרת המשותפת החופשית או מודל השרשרת דמוי התולעת. הרמה המתוחה צריכה להיות בין 50 ל -60 piconewton עבור חבל אחד. כדי לבצע את מדידות הפלואורסצנטיות, הפעל את הלייזרים הקונפוקליים ואת ספירת הפוטוסים על יחידת ומכונת פינצטה אופטית.
לאחר מכן, הפעל את לייזר העירור של אורך הגל הרצוי ואת ממשק התוכנה והגדר את כוח הלייזר ל -5% ומעלה, בהתאם לפלואורופור. כעת ניתן להתחיל בהדמיה באמצעות פונקציות התמונה או הקימוגרף של התוכנה. על מנת לקבל תמונות ממוקדות היטב, ודא כי מישור המוקד של מיקרוסקופ קונפוקלי ואת המלכודות האופטיות מיושרים.
לשם כך, ניתן להשתמש בפלואורסצנטיות של חרוזי הפוליסטירן בערוץ הלייזר הכחול. לנוע למעלה ולמטה עם המישור המוקד של המלכודות האופטיות עד autofluorescence של החרוזים מגיע הקוטר הגבוה ביותר שלה. במיקום זה, ניתן לזהות את אותות הפלואורסצנטיות המתרחשים במולקולה קשורה.
עבור שתי הפונקציות חשוב לבחור את אזורי העניין המתאימים. לאורך כל הרכב מאגר המדידה ניתן לשנות בקלות על ידי העברת החרוזים לערוצים שונים, או על ידי שינוי המאגר המסופק במערכת microfluidic. כדי למנוע הלבנת תמונות, תמיד לכבות את לייזר העירור כאשר לא מדידה.
פלט הנתונים הגולמיים מהמכשיר מכיל לעתים קרובות הרבה רעש. לכן, על מנת להמשיך לנתח נתונים מפוזרים, יש הראשון לעבד אותם מראש. השלב הראשון הוא להוריד את המדגם ולסנן את הנתונים עם מסנן Butterworth לעבור נמוך, תוצאות טובות הושגו.
לניסויי רמפה כוח, האירועים המתפתחים צריכים להיות מסומנים באזורים המקופלים והמפותלים המתאימים של עקומת המרחק הראשונה ניתן להתקין באמצעות שרשרת דמוית תולעת או מודלי שרשרת משותפים בחופשיות. עבור נתוני הכוח הקבועים, ניתן להתוות את המרחק לאורך זמן וכדאי ליצור היסטוגרמה כדי לכמת את הקונפורמציה הדומיננטית בכוח נתון. כאן מוצג כי הפרמטרים המסננים חיוניים כדי להבחין בין מצבי קיפול שונים.
כדי להבין טוב יותר מה ניתן להשיג בטכניקה זו, כמה תוצאות מייצגות מוצגות. כך נראית עקומת מרחק כוח סטנדרטית מניסוי של רמפה כוחית. במקרה זה, חקרנו את אלמנט הסטת המסגרת של SARS-coronavirus-2.
ראינו התגלגלות במספר צעדים סביב 15 piconewton. כאשר הכיוון הפוך והחרוזים מתקרבים שוב, הרצועה חוזרת בעוצמה מעט נמוכה יותר. כאשר מדדנו את אותו RNA בנוכחות חלבון אנטי ויראלי אצבע אבץ ZAP, דפוס דומה של התגלגלות נצפתה.
אבל המבנה המשני של הרנ"א לא התגלגל מחדש. זוהי דוגמה טובה כדי להראות איזו השפעה גדולה חלבון מחייב יכול להיות על קינטיקה RNA. כשמסתכלים על נתוני כוח קבועים ניתן לחקור עוד יותר את הקינטיקה המתפתחת.
המרחק לאורך זמן מתוות לכוחות שונים וההיסטוגרמה של המדינות השונות שנצפו מתווספת מימין. ב 10 piconewton, RNA הוא לגמרי במצב מקופל. ב 11.5 piconewton הוא עובר בין מדינות, וב 13 piconewton הרנ"א הוא לצמיתות במצב נפרש.
עם זאת, כאשר אלמנט הסטת המסגרת של SARS-coronavirus-2 נמדד יחד עם ZAP, ה- RNA היה לגמרי במצב של 11 piconewton, ואפילו הראה מעט מאוד מעבר למצב מקופל ב 10 piconewton. הדבר מציין כי ZAP נקשר לרכיב הסטת המסגרת התקועה היחידה ומונע היווצרות של מבנה משני. לבסוף, נבחן כמה נתוני פינצטה אופטיים יחד עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.
בניסוי זה, נעשה שימוש בצבע פלואורסצנטי המתייג חומצות גרעין נטושות כפולות, לא במיוחד עם כוח גובר. הקימוגרף מראה שככל שהחרדים מתרחקים זה מזה, עוצמת הפלואורסצנטיות עולה והיא נעלמת לחלוטין ברגע שהקשירה נמתחת יותר מדי ונשברת. באיור האחרון שכותרתו פלואורסצנטית ריבוזומים נוספו דרך ערוץ ארבע.
בניסוי זה נצפתה כריכה ספציפית של ריבוזום לקשירת הרנ"א. אנו מקווים שהסרטון הזה נתן לכם תובנה על פינצטה אופטית ומה ניתן לבצע את הטכניקה המדהימה הזו.
