הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד ניתן להשתמש בטכניקות כמו כרומטוגרפיית אי-הכללה של גודל אנליטי של מבחנים, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית ובדיקת מלווה היסטון כדי לאשר אם חלבון הוא מלווה היסטון. הטכניקות המכוסות כאן, בעת שימוש בטנדם, יכולות להיות מיושמות ישירות כדי לאפיין מלווה פוטטיבי. שלו יכול ללכת יחד עם טכניקת הביולוגיה המבנית.
הטכניקות ישימות לתחום חקר הכרומטין. עם זאת, ניתן ליישם את השיטות האינדיבידואליות על כל חלבון אחר בעל עניין, לפי הצורך. מי שידגים את ההליך יהיה מר סוראג'יט גנדי, דוקטורנט מהמעבדה שלי, על הבדיקה המסובכת של הנסיגה;גב'.
ארכאנה סמאל, סטודנטית לדוקטורט, יחד עם מר רוצ'יר ק.בודה על ניסוי האולטרה-צנטריפוגה האנליטית;מר סומנאת בראל, סטודנט לדוקטורט;יחד עם מר קטול סהרה למבחן הסופר-סליל הפלסמיד ראשית, ערבבו מלווים היסטון של חמישה מיקרומולרים עם דימרים H2A/H2B של 20 מיקרומולרים ב-300 מיקרוליטרים של חיץ שיווי משקל. צנטריפוגה של קומפלקס H2A/H2B מלווה היסטון כדי להסיר כל זריז.
טען את הדגימה על עמודת הספין שקודמה מראש בשיווי משקל עם מאגר שיווי משקל. שטפו את העמוד בנפחים של 100 עמודים או ארבעה מיליליטר של מאגר כביסה כדי להסיר עודפי H2A/H2B דימר. לאחר מכן, יש לערבב את קומפלקס H2A/H2B של מלווה היסטון עם טטרמר H3/H4 של 20 עד 60 מיקרומולר.
שטפו מחדש את העמודה בנפחים של 100 עמודים או ארבעה מיליליטרים של מאגר שטיפה כדי להסיר כל טטרמר H3/H4 לא מאוגד, ולאחר מכן חמקו את הדגימות עם מאגר אלוטיון. הכפיפו את הדוגמאות המועלות ל-18% SDS-PAGE. לאחר מכן, כתם עם Coomassie כחול מבריק R250 ולדמיין את הג'ל.
לטהר את הדימר H2A/H2B, טטרמר H3/H4 במלווה היסטון בנפרד עם מאגר הדיאליזה באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל אנליטי. שמור את המאגר מהריצה כדי להכין דילולים נוספים בהמשך ולהשתמש בו כהפניה בתא AUC. עבור דגימות AUC, ערבבו את המלווים המטוהרים עם דימר או טטרמר בצינורות נפרדים לנפח סופי של 450 מיקרוליטרים באמצעות מאגר הדיאליזה שנשמר כדי להגיע ל-OD280 של 0.3 עד 0.6.
הרכיבו את התא עם מרכז דו-מגזרי וחלונות קוורץ המסופקים עם צנטריפוגה אולטרה אנליטית עם גלאי ספיגה. מלא 400 מיקרוליטרים של תמיסת הדגימה ו -420 מיקרוליטרים של מאגר דיאליזה לתוך מגזרי הייחוס והדגימה של התא, בהתאמה. שוקלים ומאזנים במדויק את התאים וטוענים אותם לרוטור טיטניום בעל ארבעה חורים.
יישר את התאים באמצעות הסימנים בתחתית התאים והרוטור. טען את הרוטור בצנטריפוגה, סגור את המכסה והתחל את הריצה, המאפשרת לוואקום להתפתח ולטמפרטורה להתייצב. לצורך ניתוח נתונים, חשב את הצפיפות והצמיגות של רכיבי מאגר החלבונים ואת הנפח הספציפי החלקי בהתבסס על הרכב חומצות האמינו של החלבון באמצעות התוכנית SEDNTERP.
טען את הנתונים ממכונת AUC לתוכנית SEDFIT. הגדר את המניסקוס, הקו האדום, תחתית התא, הקו הכחול וגבולות ניתוח הנתונים קווים ירוקים. בחר הפצת CS רציפה כמודל.
בקטע הפרמטרים, הגדר רזולוציה מקסימלית עד 100. לאחר מכן, הגדר מקדם משקעים מינימלי לאפס ומקסימום ל 10 עד 15. הגדר את יחס החיכוך ל-1.2 בתחילה ובחר לצוף כדי לגזור את היחס מהנתונים.
הגדר את יחס F ל- 0.68 עבור רגולציית סיגמא אחת. הגדר נפח ספציפי חלקי, צפיפות חיץ וצמיגות כפי שהתקבלו מה- SEDNTURP. לחץ על הפעל כדי לאפשר לתוכנה לפתור את משוואת lam.
לחץ על Fit כדי לחדד. בחרו 'הצג שיא Mw ב-CS' בפונקציית התצוגה של סרגל הכלים הראשי כדי להעריך את המסות המולקולריות. ערבבו טטרמר H3/H4 עם שני מיקרומולרים ודימר H2A/H2B בעל ארבעה מיקרומולרים עם ריכוזים הולכים וגדלים של מלווה היסטון, החל ממיקרו-מולר אחד ועד שישה מיקרו-מולר, במאגר הרכבה ועד לנפח סופי של 50 מיקרוליטרים.
לדגור את התערובת בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. בו זמנית, יש לבצע pretreat 500 nanograms של פלסמיד PUC-19 בעל סליל שלילי עם מיקרוגרם אחד של אנזים טופואיזומראז I במאגר ההרכבה בנפח סופי של 50 מיקרוליטרים. לאחר מכן, שלבו את התמיסה המעורבת מראש המכילה טטרמר, דימר ומלווה היסטון עם הדנ"א הרגוע של הפלזמה.
הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מאגר עצירה 2X ודגירה כדי לסיים את תגובת ההרכבה על ידי דה-פרוטאינזציה של הדנ"א הפלסמיד. מוסיפים נפח שווה של פנול רווי טריס בצינור המכיל את תערובת התגובה ומערבבים היטב את תוכן תערובת התגובה. לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימה.
אוספים בעדינות את הפאזה המימית העליונה המכילה את הדנ"א הפלסמיד עם מיקרופיפטה ומערבבים נפח שווה של כלורופורם. מערבבים את התערובת. לאחר מכן, לאסוף את השלב מימי העליון, להוסיף 1/10 נפח של שלושה טוחנת נתרן אצטט של pH 5.5, ו 2.5 כרכים של אתנול קר כקרח.
מערבבים היטב את התמיסה על ידי היפוך הצינור שלוש עד ארבע פעמים. צנטריפוגה את הדגימה ב 16, 200 גרם במשך 10 דקות ולהשליך בעדינות את supernatant. השאירו את הצינורות פתוחים בטמפרטורת החדר עד שאפילו כמויות זעירות של אתנול יתאדו, וישאירו את הדנ"א הפלסמיד המשופע בצינור.
תוצאות ה- SEC האנליטיות גילו כי תחום הנוקלאופלסמין הרקומביננטי N-terminal של החלבון Arabidopsis thaliana FKBP53 הוא פנטמר של 65 קילודלטון בתמיסה. דגימת הנוקלאופלסמין שהייתה נתונה לטיפול בחום הראתה כי התחום יציב מאוד מבחינה תרמית. תחום הנוקלאופלסמין הציג יציבות מלח עד שתי טוחנות של נתרן כלורי ויציבות אוריאה עד ארבע טוחנות.
בדיקה נשלפת גילתה כי האינטראקציה של תחום הנוקלאופלסמין עם דימר H2A/H2B הייתה יציבה עד 0.4-טוחנת נתרן כלורי, בעוד שהקשר עם H3/H4 היה יציב עד 0.7 טוחנות. המלווה קושר דימר H2A/H2B וטטרמר H3/H4 בו-זמנית, ללא קשר לסדר שבו הם מתווספים למלווה, מה שמצביע על אתרי אינטראקציה נפרדים עבור האוליגומרים. המסות המולקולריות המשוערות דרך AUC-SV חושפות סטויכיומטריה ביחס של 1:1 בתחום הנוקלאופלסמין עם אוליגומרים היסטון.
בבדיקת הסופר-סליל של פלסמיד, מלווים רקומביננטיים של היסטון צמחי AtNRP1 ו-AtNRP2 הגדילו את כמות הפלסמיד הסופר-סליל, מה שמרמז על כך שהוא יכול להפקיד היסטונים על הדנ"א כדי ליצור נוקלאוזומים, מה שגורם לסליל-על של הדנ"א. בדיקת סליל-על פלסמיד זקוקה לטיפול מיוחד ואופטימיזציה אפשרית לדנ"א היסטון ולאפיון מלווה. טלמטריה של אפיון איזומרי יכולה לשמש כהמשך לניסויים אנליטיים של אי-הכללת גודל כדי לאשר את יציבות הכריכה.
