פרוטוקולים אלה הם משמעותיים כי הם מספקים צעדים מפורטים לאימות העוצמה והבחירה של מעכבי HAT הרומן, שהם כלי מחקר חשובים וטיפולים פוטנציאליים. הטכניקות המודגמות בסרטון זה קלות לביצוע ומספקות מידע על ההשפעות של מעכבי HAT על אצטילציה היסטון גלובלית ואזורית. הם מאפשרים להבין ויסות אפיגנטי של ביטוי גנים.
תשומת הלב לפרטים היא קריטית. חשוב לפעול בהתאם לפרוטוקולים צעד אחר צעד. התחל בהכנת התגובה האנזימטית בנפח של 10 מיקרוליטר בתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר בהתאם לכיווני כתב היד.
ואז להחגירה את תערובת התגובה המלאה ב 30 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת במחזור תרמי PCR. בינתיים, להוסיף שני mercaptoethanol ביחס אחד עד 10 למאגר מדגם SDS 6X. הסר דגימות מהמחזור התרמי PCR והוסף שני מיקרוליטרים של מאגר מדגם SDS מוכן לכל תערובת תגובה.
מחממים את הדגימות ל-95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות על גוש חום, ואז מקררים אותן על קרח. לאחסן את הדגימות במינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס או להמשיך עם אלקטרופורזה ג'ל immunoblotting. זרעים 100, 000 MCF-7 תאים במיליליטר אחד של מדיום תרבות התא לתוך כל באר של צלחת 12 באר ולאפשר לתאים לגדול ל 80 עד 90%confluency.
כאשר התאים מגיעים לקונפליה הרצויה, שאפו את מדיום תרבות התא מ בארות ארבע, חמש ושש, ופיפטה מיליליטר אחד של שלושה מיקרומולרים MS275 במדיום לתוך כל באר. לאחר מכן שאפו את מדיום תרבות התאים מ בארות 1, 2 ו-3, ו-pipette מיליליטר אחד של DMSO מדולל לתוך כל באר. להחזיר את התאים לאנקובטור במשך ארבע שעות כדי לאפשר הצטברות של היסטון אצטילאט בתאים חשופים MS275.
בזמן שהתאים דגירה, להכין דילול של A-485 ב DMSO על פי הוראות כתב היד. כאשר הדגירה הסתיימה, שאפו את המדיום מה בארות ומוסיפים את הדילולים. מחזירים את התאים לאנקובטור ומתרבים אותם במשך 20 שעות, ואז שאפו את מדיום תרבות התאים מה בארות ושטפו את התאים במיליליטר אחד של PBS.
שאפו את ה-PBS והוסיפו 100 מיקרוליטרים של מאגר ת ליסיס פסיבי. לאחסן את הצלחת במינוס 80 מעלות צלזיוס לילה. פיפטה 100 מיקרוליטרים של כרומטין קולי מתאים שטופלו ב- DMSO לשני צינורות 1.5 מיליליטר, ואז פיפטה 400 מיקרוליטרים של מאגר דילול ChIP לכל צינור כדי להביא את הנפח הכולל עד 500 מיקרוליטר.
הסר חמישה מיקרוליטרים של הפתרון מאחד הצינורות ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס כקלט DMSO. הכינו שני צינורות עם כרומטין קולי מתאים שטופלו ב-A-485 באותו אופן. השתמש פיפטה כדי להוסיף את נוגדני אצטיל IgG ו H3K27 לדגימות DMSO ו- A-485.
לאחר מכן מוסיפים 20 מיקרוליטרים של חלבון חרוזים מגנטיים לכל צינור, מוודאים כי חרוזים הם resuspended היטב. סובב את הדגימות בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. גלולה החלבון חרוזים מגנטיים באמצעות מפריד מגנטי ולהסיר את supernatant מבלי להפריע את חרוזים.
לשטוף את חרוזים עם 500 microliters למיליליטר אחד של חיץ לשטוף מלח נמוך ולסובב אותם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. בצע ספין מהיר למטה, גלולה את חרוזים עם מפריד מגנטי ולהסיר את supernatant. חזור על הליך הכביסה עם מאגר שטיפת מלח גבוה, מאגר שטיפת ליתיום כלורי ומאגר TE.
לאחר הכביסה עם מאגר TE, להסיר את דגימות הקלט מהמקפיא ולשים אותם על קרח. להפשיר aliquot של proteinase K, ולאחר מכן גלולה את חרוזים באמצעות מפריד מגנטי ולהסיר את מאגר TE מן חרוזים. הוסף 100 מיקרוליטרים של חיץ אלוטיון ChIP ומיקרוליטר אחד של proteinase K לכל מדגם כולל דגימות הקלט ודגירה אותם עם רועד ב 62 מעלות צלזיוס במשך שעתיים באמצעות תרמוצ'ילר.
לאחר הדגירה, מחממים את הדגימות ל-95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואז מקררים אותן לטמפרטורת החדר. גלולה את חרוזים מגנטיים עם מפריד מגנטי ולהעביר את על טבעי המכיל DNA לצינור חדש 1.5 מיליליטר. לטהר את ה-DNA באמצעות ערכת ניקוי PCR סטנדרטי ולהפעיל qPCR.
ההיסטרו היסטון אצטילטרנספראז משמש כדי לחקור את ההשפעה של חומצה אנקרדית על פעילות p300 HAT כלפי מצע היסטון. טווח ריכוז נבדק ואצטיל-CoA לא נוספה לתגובת הבקרה השלילית. תוצאות immunoblot היו לכמת עם ImageJ, מראה ירידה ברורה אצטיל H3K18 ו אצטיל H3K9 ב 100 מיקרומולרית חומצה אנקרדית בהשוואה לבקרת DMSO.
בדיכוי עיכוב אצטילציה-יתר כרומטין, טיפול בתאי MCF-7 עם HDACi MS275 אצטילציה מווסתת בחוזקה של היסטון 3 על מספר שאריות ליזין. רמות בסיס של אצטיל H3K18 ו אצטיל H3K27 היו נמוכים, מראה את היתרונות של הוספת HDACi בהצגת ChHAI. התוספת של A-485 בתאים שטופלו מראש עם MS275 מזרזת את האצטילציה המוגברת של אבן היסטון ב- H3K18 ו- H3K27, אך לא H3K9.
תוצאות האימונובלות גם כומתו עם ImageJ. ChIP qPCR שימש כדי לחקור את ההשפעות של מעכבי HAT על אלמנטים רגולטוריים גנים השליטה ביטוי oncogene. בדגימה DMSO, ה-DNA זירז על ידי נוגדן בקרת IgG הפיק ערך Ct גבוה יותר מאשר נוגדן H3K27 אצטיל בתגובת qPCR עבור מקדם D1 ציקלין, המציין כי בקרת IgG לא ספציפי זירז פחות קומפלקסים histone DNA מאשר נוגדן H3K27 אצטיל ספציפי אצל האמרגן.
בהשוואה לבקרת DMSO, A-485 הפחית את העשרת האצטיל H3K27 אצל מקדם D1 ציקלין. חשוב לציין, A-485 ידוע להפחית באופן משמעותי אצטיל H3K27 בתרבות התא. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי צעדי טרום הדגירה של המשגיחים במבחנה HAT ו ChHAI הם חיוניים ולא צריך לשכוח.
חשוב גם לזכור לשמור את דגימות הקלט כדי למנוע אובדן של חרוזים במהלך ChIP. לאחר ביצוע הליכים אלה, ChIP-seq היא שיטה נוספת שניתן לבצע כדי לקבל מידע גלובלי על אצטילציה היסטון באלמנטים רגולטוריים עבור הגנום כולו. פרוטוקולים אלה מועילים למדענים לאמת בזהירות מעכבי HAT חדשניים ולהימנע מפרסום בדיקות כימיות באיכות נמוכה בספרות.
מעכבי HAT מאומתים יכולים לעבור התפתחות נוספת כטיפולים פוטנציאליים.
