כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

ישנן מספר שיטות למדידת ייצור ROS, או עקה חמצונית בתאים. בין אלה, 2'7'dichlorofluorescein דיאקאט בדיקה היא אחת הטכניקות הנפוצות ביותר למדידה ישירה של מצב redox. בדיקה זו היא ליפופילית ולא פלואורסצנטית. דיפוזיה של בדיקה זו על פני קרום התא מאפשרת את מחשוף אסטראזות תאיות בשני קשרי אסתר, לייצר מוצר קוטבי יחסית קרום התא אטום. מולקולות לא פלואורסצנטיות אלה מצטברות באופן תאי, והחמצון שלאחר מכן על ידי ROS מניב את המוצר הפלואורסצנטי ביותר דיכלורופלואורסצ'ין. החמצון של הגשוש הוא תוצר של פעולה של סוגים מרובים של ROS. אשר ניתן לזהות על ידי ציטומטריית זרימה או מיקרוסקופיה קונפוקלית. במאמר זה, השתמשנו בדיקה dichlorofluorescein diacetate כדי למדוד ולכמת ROS על ידי cytometry זרימה. מעבירים צלחות של 6 בארות למכסה מנוע לזרימה למינארית מהחממה. שאפו את הסופר-נאנט. ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. יש להוסיף 2 מ"ל של DMEM בסרום נמוך לבאר. ולדגור את צלחת 6-well במשך שעתיים באינקובטור. לטפל בתאים עם נוגד חמצון במשך שש שעות. לטפל בתאים עם ממריץ ROS, A או B, במשך 30 דקות. שאפו את הסופר-נאנט. ולשטוף את התא שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר את כל הגירויים. כבה את האור של מכסה המנוע לזרימה למינארית ועבוד בחושך. הוסף 1 מ"ל של dichlorofluorescein דיאקטט בדיקה ב DMEM ללא אדום פנול. הוסף 1 מ"ל של DMEM ללא אדום פנול לתאי בקרת בקרת הזרימה האוטומטית של הבקרה. לדגור על צלחת 6-well במשך 30 דקות באינקובטור. העבר את הצלחות על קרח למעבדה. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של PBS קר לכל באר. הוסיפו 0.5 מ"ל של חיץ ניתוק קר לכל באר. לקצור את התאים על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה P1000. לאסוף אותם בצינור 1.5 מ"ל שכותרתו. וצנטריפוגה אותם ב 600 x g במשך חמש דקות ב 4 C. להשליך את supernatant בזהירות, בעדינות לנתק את הכדור עם הקשה. הוסף 1 מ"ל של מאגר FACS כדי לשטוף את התאים לכל צינור שכותרתו. אם יש צורך, להשתמש במערבולת בעוצמה הנמוכה ביותר עבור ניתוק מלא של הכדור. צנטריפוגה אותם ב 600 x g במשך חמש דקות ב 4 C.חזור על שלב זה פעמיים יותר. שלוש כביסות בסך הכל. Resuspend כדורי תאים ב 200 L של מאגר FACS. בעדינות לנתק לחלוטין את הכדור בכל צינור באמצעות מערבולת. ולהעביר ל-5 מ"ל מסומנים לצינורות ציטומטר זרימה. שמור את הצינורות על קרח עד לנתח על cytometer זרימה. באמצעות תוכנת ציטומטריית הזרימה, צור ניסוי חדש. לחץ על הדגימה ויפתח רשימה של צינורות. לחץ פעמיים ושנה את שמם. מניחים את צינור בקרת הזרימה האוטומטית על זרוע השאיפה, ומזיזים את הבסיס בזהירות רק שמאלה. לחץ על רכש נתונים ולאחר מכן רשום נתונים ובחר את תנאי העצירה הרצוי. צייר שער סביב התאים המעניינים, למעט תאים מתים ופסולת. הסר את הצינור. לחץ על הצינור הבא והפעל את דוגמת הבקרה הבסיסית. לחץ על רכש נתונים ולאחר מכן ב- Record Data.Open את התוכנה. הוסף את הדוגמאות באמצעות לחצן הפעולה הוסף דוגמאות. לחץ על הוסף דוגמה.בחר את התיקיה תאריך ניסיוני ולחץ על Choose.Double לחץ פעמיים על המדגם הראשון בסביבת העבודה שלך, פקד זרימה אוטומטית במקרה זה. צייר שער מצולע כדי לבודד את תא העניין, למעט תאים מתים ופסולת. שנה את העלילה להיסטוגרמה. לחץ פעמיים בתוך ה- M