גילוי של מינים החמצן תגובתי כוללת בתאי חסיד על ידי 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון di, מכתים

שיטה זו יכולה לשמש לניתוח מיני חמצן תגובתי תאי בתאים חסידיים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בלבד, ולכומת את עוצמת מיני החמצן תגובתי עם קורא לוחיות פלואורסצנטיות. פרוטוקול זה פשוט, יעיל וחסכוני. התחל על ידי זריעה פעמיים 10 לתאי סרטן המעי הגס HCT116 החמישי ב- DMEM לתוך כל באר של צלחת 24 באר.

דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, החלף את מדיום התרבות ב-100 מיקרומולאר ברזלי גופרתי, או 10 מדיום המכיל טוקסורוביצין מיקרומולארי, ודגירה של הצלחת למשך 24 שעות נוספות. הכן את פתרון DCFH-DA על-ידי המסת 4.85 מיליגרם של DCFH-DA במיליליטר אחד של DMSO כדי ליצור פתרון מלאי של 10 מילימולרים.

ממש לפני הוספתו ל בארות, לדלל את המניה עם DMEM מחומם מראש כדי להפוך פתרון עבודה 10 micromolar, ו מערבולת זה במשך 10 שניות. כדי להכתים את התאים, להסיר את המדיום המכיל סמים, ולשטוף אותם פעם אחת עם DMEM. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של פתרון עבודה DCFH-DA לתוך כל באר, ו דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

לאחר הדגירה, להסיר את DCFH-DA מן בארות, ולשטוף אותם פעמיים עם DMEM, ופעם אחת עם PBS. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של PBS לכל באר. השתמש בתעלת החלבון הפלואורסצנטי הירוק במיקרוסקופ הפלואורסצנטי כדי לצלם תמונות מייצגות של התאים.

לאחר מכן הסר את PBS, ולהוסיף 200 microliters של מאגר בדיקה radioimmunoprecipitation לכל באר. דגירה את הצלחת על קרח במשך חמש דקות, ולאסוף את lysates התא לתוך 1.5 צינורות מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות ב 21, 130 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

ואז להעביר 100 microliters של supernatant לצלחת שחורה 96 באר. השתמש בקורא מיקרופלסטיק באורך גל של 485 ננומטר, ואורך גל פליטה של 530 ננומטר, כדי למדוד את הפלואורסצנטיות בכל באר. לאחר מכן, למדוד את ריכוז החלבון עם בדיקה ברדפורד על ידי העברת microliter אחד של supernatant לצלחת ברורה 96 גם עם 100 microliters של פתרון בדיקה חלבון.

השתמש בריכוזי החלבון כדי לנרמל את התעצמות הפלואורסצנטיות. HCT116 תאים סרטניים המעי הגס טופלו עם 100 מיקרומולאר ברזלי סולפט, או 10 דוקסורוביצין מיקרומולרי, כדי לגרום ללחץ חמצוני. כצפוי, פלואורסצנטיות ירוקה הוגדלה באופן דרמטי על ידי שני הטיפולים.

כדי לכמת את השינויים בעוצמה היחסית, התאים היו lysed ו מנורמל עם ריכוזי חלבון. עוצמת הפלואורסצנטיות היחסית הוגדלה באופן משמעותי על ידי ברזלי סולפט או טוקסורוביצין. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להפוך את פתרון DCFH-DA טרי ולהימנע מחשיפה לאור, כמו גם למזער את ההפרעה למצב התא, ולבצע שטיפה נרחבת של PBS ממש לפני צילום תמונה.

בנוסף לגילוי של ROS הכולל על ידי פרוטוקול זה, במיוחד ROS כגון חמצן יכול להתבצע.