לכן המעבדה שלי מתעניינת בהבנה כיצד העין והמוח גדלים יחד. טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור כיצד קלט רשתית משפיע על צמיחת המוח והתפתחותו. הסרה כירורגית של עין אחת מדגי הזברה הזחלים החיים, ולאחר מכן תצפית על טקטום אופטי מאפשרת לנו להשוות אונות טקטליות עצבניות ומנוכרות בתוך אותה חיה ובין בעלי חיים.
שילוב טכניקה זו עם גישות מולקולריות מודרניות יכול לתת תובנה חדשה לגבי מנגנונים העומדים בבסיס ההתפתחות העצבית, ההתחדשות והניוון. כדי להתחיל, לחבר את חוטי הקתודה והאנודה לספק הכוח. חברו את מהדק התנין בקצה חוט הקתודה לפיסת נייר ישריקה חלקית והכניסו את תמיסת התן לתמיסת האשלגן הידרוקסיד, והצמידו אותו לצד הצנצנת.
חבר את קליפ התנין של חוט האנודה לצווארו של מחזיק המחט. הופכים את ההספק לכ-20 וולט וטבולים את חוט הטונגסטן בתמיסת האשלגן הידרוקסיד, ושולפים את החוט מהתמיסה בזווית כדי לחדד את החוט באופן אלקטרוליטי לקצה דק. בדוק את קצה המחט מתחת למיקרוסקופ הניתוח כדי לוודא שהיא חדה מספיק.
קצה המחט העקומה נוצר כאשר המחט החדה כפופה על ידי נגיעה עדינה בה לצלחת פטרי. ביום הניתוח, השתמשו בפיפטת מרעה מזכוכית רחבה כדי להעביר 10 עד 15 זחלים לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטרים במילוי E3 טרי. הוסיפו שלוש עד חמש טיפות של חומר הרדמה לזחל. כדי לקבוע אם הזחלים מורדמים כראוי, חפשו חוסר תגובת מגע.
הוסיפו עוד שתיים-שלוש טיפות של חומר ההרדמה אם הזחלים עדיין מגיבים למגע לאחר שלוש דקות ומעריכים מחדש. כדי לשתק את הזחל לניתוח, קחו זחל אחד למעלה לתוך פיפטת מרעה מזכוכית צרה עם כמות קטנה בלבד של E3. לאחר מכן, קחו כ-200 מיקרוליטרים של נקודת התכה מומסת של 1% נמוך או אגרוז LMP לתוך הפיפטה המכילה את הזחל וערבבו כדי להבטיח שהזחל תלוי באגרוז LMP. מניחים את המכסה של צלחת פטרי באורך 35 מילימטרים הפונה כלפי מעלה מתחת למיקרוסקופ המנתח, ואז מתיזים את הזחל ואת האגרוז על מכסה צלחת פטרי ההפוך.
מורחים את האגרוז כך שהזחל נמצא במרכז הטיפה. באמצעות מחט טונגסטן עמומה, מתמרנים במהירות אך בעדינות את הזחל כך שהוא לרוחב עם עין אחת הפונה כלפי מעלה. המתן מספר דקות עד שהאגרוז ישקע.
בעקבות קצה מסלול העין, השתמש בקצה של מחט טונגסטן עדינה שהושחזה אלקטרוליטית כדי לחדור את העור סביב העין. לאחר מכן החליקו את קצה המחט מתחת לעין מהצד הטמפורלי-גחוני של העין. השתמש בלחץ מבוקר כדי לשחרר את העין מהשקע.
ממשיכים ללחוץ על העין באופן דורסלי וקדמי עם צד המחט, ובסופו של דבר חותכים דרך עצב הראייה ומשחררים את העין. לחלופין, אתה יכול להשתמש במלקחיים כירורגיים עדינים מאוד כדי להסיר את העין על ידי צביטה של עצב הראייה ודחיפת העין ממדיאלית לרוחבית. לאחר הסרת עיניים מוצלחת, מכסים את האגרוז בתמיסת MMR, משחררים כל זחל מהאגרוז על ידי הברשה עדינה של מחט טונגסטן סביב ראשם ולאחר מכן סביב גופם, תוך ייצוב מכסה כלי הפטרי עם מלקחיים.
לאחר הניתוחים, מניחים את הזחל בתמיסת MMR בתוספת אנטיביוטיקה עד למחרת, ואז מחזירים את הזחל ל-E3 ומגדלים אותם עד לנקודת הסיום של הניסוי. לאחר שהזחלים מורדמים באופן סופני, תקן אותם עם 4% paraformaldehyde. תלו את הזחלים הקבועים בטיפות PBS על צלחת מגן כלבי ים תחת מיקרוסקופ מנתח.
אבטח אותם לרוחב על ידי הנחת שני סיכות טונגסטן דרך הנוטוכורד עם סיכה אחת אחורית לאזור הפיגמנטי המכסה את אזור AGM ואחרת בקו אחד בקו אחד עם קצה הרחבת החלמון. הסר את העין עם מחט טונגסטן חדה ומלקחיים עדינים. לפעמים אפשר לתקוע את המחט דרך הלסת לצד הנגדי ולהסיר את העין השנייה.
השתמש במחט הטונגסטן כדי לגרד מהצד הטמפורלי לצד הגחוני של האוזן. באותה פעולה בתנועה, הביאו את המחט האחורית ללסת ומשכו בעדינות קדימה עד שהאוזן והלסת מוסרות. הסר את העין והאוזן האחרות על ידי דקירת המחט דרך הלסת.
השתמש במלקחיים כדי לשלוף את איברי הגחון ואת החלמון הנותר. לבסוף, בצע חתך רדוד בעור הגולגולת הגבי ליד הצומת בין המוח האחורי לחוט השדרה. הרימו את העור עם המלקחיים ומשכו אותו קדימה וסביב הטלנספלון.
הסר את כל הרקמה שנותרה עם מלקחיים. שחררו את הזחל והעבירו ל-PBS לצינור מיקרו-סנטריפוג של 1.5 מיליליטר. הצמידו שקופית עם תא למכסה של צלחת פטרי בקוטר 100 מילימטרים עם שומן ואקום.
מעבירים את הזחלים המוכתמים במערכת החיסון והמעובדת לצלחת באר או לשקופית שקע כדי לצפות בהם באמצעות מיקרוסקופ מנתח. הר את הזחל על המגלשה הקאמרית בעמודי אגרוז LMP 1%. בעזרת מעבר לפיפטה שלכם, הניחו זחל אחד על המגלשה הקפואה, והפקידו כמה שפחות PBS.
מכסים את הזחל באגרוז 1% LMP מומס וחם באמצעות אותה פיפטה. פיפטה את אגרוז ה-LMP לתוך עמודה ואז מיקמה את הזחל בצורה סימטרית ככל האפשר כאשר המשטח הגבי נראה לעין. לאחר הסרת העיניים, ניוון פרוגרסיבי של אקסונים ברשתית נצפה בנוירופיל טקטום אופטי.
ביומיים שלאחר הניתוח, RFP שכותרתו אקסונים הציגו סימני היכר של התנוונות וולרית מהירה, כגון התלקחות ופיצול. פונקטה חיובית RFP צוינה הן בתוך הנוירופיל והן מחוצה לו בצד ימין של הטקטום כפי שצוין על ידי החצים. במשך ארבעה ימים לאחר הניתוח, אקסונים מקוטעים ופסולת אקסונאלית עם תווית RFP הצטמצמו במידה ניכרת באונה הטקטלית הימנית, מה שמעיד על פינוי מהיר יחסית של האקסונים הגוססים והמתנוונים.
המוח נחשף על ידי ניתוח העיניים, הלסת, האוזניים וכיפה של העור ורקמות החיבור. באופן אידיאלי, המוח נשאר שלם במהלך הליך זה. עם זאת, חלקים במוח הקדמי, במיוחד נורת חוש הריח, ככל הנראה ניזוקו או הוסרו לחלוטין כאשר מכסה הגולגולת של העור או הלסת הוסר.
יתר על כן, לפעמים המדף הצדדי של הטקטום נפרס בעת פירסינג או צביטה של העור כדי למשוך אותו מהמוח. אין שתי דגימות זהות. אז אתה צריך להיות מסוגל לבצע התאמות עדינות באמצעות הסרת העיניים וכריתת המוח לפי הצורך.
מטופלים וכלים חדים חיוניים להצלחה. ניתן לעקוב אחר טכניקה זו עם גישות תאיות ומולקולריות, כמו הדמיית תאים חיים in vivo או ריצוף RNA כדי לקבל תובנות חדשות על המנגנונים המולקולריים והתאיים של גדילה והתפתחות של טקטום אופטי.
