ההבנה שלנו של מורפוגנזה העין מגיעה ממחקרי רקמות קבועים קודמים. עם זאת, מחקרים אלה חסרים דינמיקת תאים ורקמות. באמצעות הדמיה של זמן לשגות, אנו מסוגלים ללכוד את כל התהליך הזה להדמיה וניתוח.
השיטה שלנו המנצלת את ההתפתחות החיצונית בבהירות אופטית של עוברים דגי זברה, המאפשרים הדמיה חיה, ומשתמשת במיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר הזמינה ברוב קמפוסי המחקר. חוקרים חדשים בשיטה זו צריכים לצפות לניסוי וטעייה לפני קבלת ערכת נתונים שמיש. צעדים רבים, במיוחד הזריקות וההטבעה, חייבים ללכת טוב כדי להצליח, אז יש סבלנות.
ברגע שדג הזברה מתחיל להתרבות, בזמן שהוא ממתין 15 עד 20 דקות כדי להבטיח שהביצים מופרות, השתמש בפיפטה P10 ובמיקרוליטר P10 כדי לגבות לטעון מחט הזרקת מיקרו נימית מזכוכית משוך עם 2.5 עד 5 מיקרוליטרים של דילול RNA של עניין. כאשר הביצים מוכנות, השתמש פיפטה העברה ומיקרוסקופ לנתח כדי לטעון את הביצים בזהירות לתוך תבנית ההזרקה, באמצעות מלקחיים כדי לגלגל את העוברים, כך התא הבודד גלוי לפי הצורך. לאחר מכן הזריקו את כל העוברים בשלב של תא אחד, תוך התמקדות בתא ולא בחלמון כדי להבטיח תיוג אחיד של העובר המתפתח.
בערך 11 שעות לאחר ההפריה, מניחים עליקוט של 1 עד 5 מיליליטר של 1.6% אגז נמס נמוך ב- E3 בינוני בבלוק חום של 42 מעלות צלזיוס והשתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסנן עוברים מוזרקים בהצלחה עם בהירות כוללת של פלורשנס. תספור את הסומיטים כדי לביים כראוי את העוברים. ב 11 שעות לאחר ההפריה, שלושה סומיטים יש לראות.
מדגם אידיאלי יהיה אותות EGFP ו mCherry חזקים ולהיות בשלב ההתפתחותי הנכון. לפני הרכבה, מניחים את העוברים בצלחת מצופה אגר ומשתמשים במלקחיים כדי להסיר את הכוריון מכל עובר. כאשר כל העוברים הוקעו, השתמש בצינור גליל זכוכית כדי לשאוף עובר אחד.
יש לפלוט כמה שיותר E3 כך שהעובר יושב בקצה זכוכית פיפטת פסטר ושחררו את העובר לתוך צינור האגארוז מבלוק החום. תן לעוברים לשקוע לתוך האגורוז במשך כמה שניות לפני שאיפה נפח קטן של אגרוז יחד עם העובר, תוך טיפול כי העובר נשאר בקצה הצינור. מוציאים את העובר והאגורה לטיפת אגרוז בצלחת תחתונה של זכוכית ומנצלים במהירות אך בזהירות מלקחיים כדי לכוון את צד הגב של העובר כלפי מטה לפני שהטיפת אגרוז מתקשה.
לאחר הרכבה 10 עד 12 עוברים באותו אופן, להוסיף מספיק agarose כדי לכסות לחלוטין את החלק התחתון של המנה עוטף את כל הטיפות בדיסק אגרוז אחד. כאשר האגורוז התקשה, שכבה E3 מעל האגורוז כדי לשמור על הדגימות hydrated. לאחר הגדרת המיקרוסקופ הקונפוקל סורק לייזר לפרמטרים המתאימים להדמיה בזמן לשגות, מצפים בנדיבות את החלק התחתון של צלחת התחתונה של הזכוכית עם מדיום טבילה התואם את האינדקס השבירה של מים, דואג להימנע מבועות אוויר, ולהחיל טיפה קטנה של מדיום טבילה על המטרה של מים 40X.
אבטחו את צלחת הזכוכית התחתונה בהכנסת הבמה והוסיפו מדיום E3 נוסף כדי לשמור על העוברים לחים למשך הלילה. השתמש חימר דוגמנות כדי לאטום את מכסה הפלסטיק מעל המנה ולהעלות את המטרה כדי ליצור קשר עם המנה. תחת כותרת המיקום של תוכנת המיקרוסקופ, לחץ על הוסף כדי לשמור את מידע XYZ של המדגם הראשון שיחו על-ידי זמן קצר ולבחור מדגם עם פלואורסצנטיות חזקה והרכבה אופטימלית.
תחת הכרטיסיה איתור, חפש את הדוגמה הבאה ולחץ על מיקום והוסף כדי לבחור את הדוגמה כפי שהודגמה. לאחר בחירת כל הדוגמאות, סמן את המיקום הראשון ולחץ על מעבר אל. תוך כדי סריקה רציפה, מסדרים את ההבל האופטי בתוך המסגרת, ומשאירים מקום רב באזורים הנעשים והדיסטליים ביחס ללסת הראייה והמוח.
כדי להקצות את פרוסת Z הראשונה והאחרונה, בחר את הסט הראשון והגדר אחרון תוך כדי מעבר דרך כיוון Z עם ידית המיקוד העדינה, תוך שמירה על מספר פרוסה כולל של כ-63 כדי להתאים לצמיחת הכוס האופטית. כלול חדר נוסף בצד הגחון של ארסית הראייה כדי לאפשר מקום לצמיחה. לאחר שנקבעו פרוסות Z הראשונה והאחרונה, לחץ על C כדי לעבור למרכז מחסנית Z ולהתאים את כוח הלייזר ולהשיג עבור שני הלייזרים.
לאחר הגדרת עוצמת הלייזר והרווח, הפסק את הסריקה ולחץ על העדכון כדי לעדכן את פרטי המיקום. כדי לעבור למיקום הבא, לחץ על מיקום 2. לאחר שגם פרוסת Z הראשונה וגם האחרונה הוגדרו כפידגמו, פתח את כותרת סידרת הזמן והגדר את מספר המחזורים ל- 300 ואת מרווח הזמן ל- 2.5 דקות.
לאחר סקירת ההגדרות כדי לוודא שהכל סופי, לחץ על התחל כדי להתחיל את זמן ההפוגה ואשר כי הסיבוב הראשון של הדמיה נלכד כראוי לפני מתן אפשרות לתקופת זמן לרוץ בן לילה. הזרקה ישירה לתא הבודד נחוצה לתיוג אחיד ופלואורסצנטיות חזקה. עם טבילתם באגרוז, העוברים צריכים להיות מרווחים באופן שווה לאורך כל המנה.
אם העוברים מבוימים כראוי, פלואורסצנטיים מספיק ומורכבים כראוי, הם יישארו במסגרת ההדמיה במהלך מעידת הזמן, מה שיאפשר את הדימוי של האיבר כולו. דגימות שאינן מכוונות לאורך ציר הגב, כגון אלה אופקיות או אלכסוניות, יגדלו מתוך מסגרת ההדמיה ככל שהזמן יפוג ולא ניתן יהיה להשתמש בהן לניתוח נוסף. עובר שסובב יתר על המידה יגרום לשקיעת זמן אחורית יותר.
עובר שאינו מסובף לא יאפשר רק את הרקמה הימנית ביותר לצפייה. בנוסף, דגימות המותקנות ביחס לכיוון המסגרת נוטות יותר להניב זמן מוצלח. הטיה זו כלפי הצד הגחון מספקת מרחב נוסף לצמיחת רקמות בכיוון הגחון וכתוצאה מכך מעידת זמן אופטימלית.
כאשר קריטריונים אלה אינם מתקיימים, זמן-לשגות כבר לא ללכוד את כל נפח 3D של הרקמה כפי שהוא מתפתח ולא ניתן להשתמש בו לניתוח נוסף. ניתן לנתח ערכות נתונים עשירות במידע אלה בדרכים רבות, כולל מעקב אחר תאים 4D עם מהירות תאים וכימות מסלול, מדידות נפח תאים ורקמות ופריטים חזותיים 3 ו- 4D.
