כליות שלמות כתמים תלת מימדיים עם CUBIC

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של מבנים תלת-ממדיים בכליה מלאה, מה שיכול להוביל לתגליות חדשניות בחקר הכליות על ידי מתן פרספקטיבה מקרוסקופית. צביעת איברים שלמים היא מאתגרת בגלל הקושי בחדירת נוגדנים. פרוטוקול זה הדגים את הכתמים האיכותיים והשלמים של הכליות על ידי הנוגדנים.

כדי להתחיל, בצע את קיבוע הטבילה מיד לאחר קיבוע הזלוף ודגימת הכליות, על ידי טבילת הכליה ב 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. יש לתת שלוש כביסות באמצעות PBS למשך שעתיים כל אחת. בצע את תהליך הדה-צביעה וההעדכה על-ידי טבילת הכליה הקבועה בשבעה מילימטרים של 50% CUBIC-L בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר, עם ניעור עדין בטמפרטורת החדר.

לאחר שש שעות, לטבול את הכליה בשבעה מיליליטר של CUBIC-L בצינור 14 מילימטר עגול תחתון, עם רעידות עדינות ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים. רעננו את CUBIC-L מדי יום. לאחר השלמת הצביעה וההשחתה, השתמשו בכף חלוקה לטיפול בדגימה ושטפו את הכליה שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

Immunostain הכליה הפגועה בנוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חיץ מכתים, עם ניעור עדין בשייקר אינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים. לאחר מכן, לשטוף את הכליה עם 0.5% Triton X-100 ב PBS, הידוע גם בשם PBST, בטמפרטורת החדר ליום אחד. לכתמי נוגדנים משניים יש לטפל בכליה עם נוגדנים משניים במאגר המכתים, בחושך, עם ניעור עדין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שבעה ימים.

לתקן את הכתמים עם שטיפת PBST בטמפרטורת החדר למשך יום אחד. לאחר הקיבוע, יש לטבול את הכליה בפורמלדהיד 1% ב-PB למשך שלוש שעות, ולשטוף אותה עם PBS בטמפרטורת החדר למשך שש שעות. בצע את התאמת מקדם השבירה על ידי טבילת הכליה בשבעה מיליליטר של 50% CUBIC-R+בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר עם טלטול למשך יום אחד, ולאחר מכן טיפול בשבעה מיליליטר של CUBIC-R+עם ניעור בטמפרטורת החדר למשך יומיים.

בעזרת שיטת מכתים חיסונית, עצבים סימפתטיים ועורקים בכליה שלמה הודגמו בהדמיית כליות תלת ממדית. יתר על כן, עצבים סימפתטיים כלייתיים חריגים הודגמו לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה. פרוטוקול זה גם הקל על הדמיה של עצבים סימפתטיים בכל הטחול.

תהליך כימות הנתונים עבור צביעה אימונופלואורסצנטית תלת מימדית מוצג כאן. בנוסף, איסוף צינורות, קטע S1 של צינוריות פרוקסימליות, ואת glomeruli היו דמיינו בהצלחה בכליה שלמה. גלומרולאומגהליה מדוכאת, הנובעת ממתן תרופות בשלבים המוקדמים של מחלת כליות סוכרתית, הודגמה גם בהדמיה תלת-ממדית.

פרוטוקול זה יכול לסמן את המולקולה הספציפית בתוך כליה שלמה. לפיכך, חוקרים יכולים לנתח שינוי מבנה בכלי הדם או למצוא אירועים נדירים ברקמות הכליה.