מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82204951) ותוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (2020JDRC0102).

במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 בוגרים (בני 6 שבועות, 25-30 גרם). כל ההליכים בוצעו בהתאם לתקנות המקומיות של רווחת בעלי חיים ואתיקה ניסויית. המחקר אושר על ידי בית החולים מערב סין של ועדת האתיקה למחקר ביו-רפואי באוניברסיטת סצ'ואן.
1. תיוג גלומרולי והכנת רקמות
<ol><li>תיוג גלומרולי<ol><li>יש להמיס את FITC-דקסטרן (10 מ"ג) במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ביחס של 1:1 (1 מ"ג: 1 מ"ל) להכנת תמיסת הבדיקה העובדת. הערה: ניתן לאחסן את פתרון העבודה ב- 4 °C למשך חודש אחד.</li>
		<li>הנח את העכבר C57 בקיבוע ורידים זנב עכבר. להרטיב את הגזה עם מים חמים, לעטוף את הגזה סביב החלק האמצעי של זנב העכבר, ולחמם את הזנב במשך 1 דקות.</li>
		<li>נגב את זנב העכבר עם אתנול 75% עד שרידי הזנב השמאלי והימני גלויים.</li>
		<li>צייר 100 μL של פתרון הבדיקה עובד עם מזרק אינסולין 1 מ"ל להזריק לאט את הפתרון לתוך וריד זנב העכבר.</li>
		<li>לאחר ההזרקה, תן לתמיסת הבדיקה להסתובב במשך 30 דקות. אפשרו לעכברים לנוע בחופשיות בכלובים שלהם.</li>
		<li>לאחר השגת זרימת דם מספקת, להרדים עמוקות את העכברים על ידי הזרקה intraperitoneal של נתרן pentobarbital (1%, 60-80 מיקרוגרם / ק"ג).</li>
	</ol></li>
	<li>דגימת כליות וקיבוע<ol><li>קבע את העכברים המורדמים לצלחת האנטומית במצב שכיבה. אבטחו את כפותיהם בעזרת סרט רפואי.</li>
		<li>לאחר הכנת העור, להרדים את העכברים עם מינון קטלני של נתרן pentobarbital (1%, 10 מ"ג / ק"ג).</li>
		<li>בצע חתך בטן בקו האמצע כדי לחשוף את חלל הבטן.</li>
		<li>לחשוף את הכליות ולהסיר אותם עם אזמל ומספריים במכסה האדים. הסר את מעטפת הכליה בעדינות.</li>
		<li>לאסוף את הכליות ולקבע אותם 4% paraformaldehyde (PFA) ב 4 °C (75 °F) במשך הלילה.</li>
		<li>שטפו את הדגימות עם PBS שלוש פעמים שעה כל אחת עם ניעור בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>הכינו את הכליה למיקרוסקופ.<ol><li>פורסים את הכליה למיקרוסקופ קונפוקלי: חותכים את הכליה לפרוסות בעובי 1 מ"מ באמצעות מטריצת המוח (1 מ"מ פלדה, 40-75 גרם) כדי לתקנן את עובי הפרוסה. מעבירים את הפרוסות ל-4% PFA וממשיכים בקיבוע ב-4°C למשך הלילה.</li>
			<li>כליה שלמה למיקרוסקופ יריעות אור: לתקן את הכליות ב 4% PFA ב 4 ° C במשך 48 שעות.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. סליקה
<ol><li>הכנת מגיב<ol><li>הכינו מגיב CUBIC-L על ידי ערבוב 10% (wt/wt) N-butyldiethanolamine, 10% (wt/wt) Triton X-100 ו-80% ddH2O.</li>
		<li>הכן מגיב CUBIC-R על ידי ערבוב 45% (wt/wt) אנטיפירין, 30% (wt/wt) ניקוטינאמיד, 0.5% (vol/vol) N-butyldiethanolamine ו-24.5% ddH2O. ודא שלתמיסה יש pH של 9.6-9.8 ומדד שבירה (RI) של 1.522. הערה: CUBIC-L משמש להסרת שומנים, ו- CUBIC-R משמש להתאמת אינדקס שבירה.</li>
	</ol></li>
	<li>הליך סליקה<ol><li>לאסוף את דגימות הכליה בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל ולאחר מכן לנקות אותם CUBIC-L עם רעד ב 60 סל"ד ב 37 ° C. יש להחליף את CUBIC-L כל 4 שעות (לפרוסות כליה) או כל 24 שעות (לכליה שלמה) עד להשגת שקיפות אופטית משביעת רצון. הערה: תהליך זה לוקח יום אחד עבור פרוסות כליה ו 5 ימים עבור כליה שלמה.</li>
		<li>שטפו את הדגימות שלוש פעמים ב-PBS בניעור עדין ב-RT במשך שעה כל אחת.</li>
		<li>יש למרוח CUBIC-R על הדגימות, תוך ניעור הדגימות בטמפרטורה של 37°C, 60 סל"ד למשך 6 שעות.</li>
		<li>התבונן ישירות בדגימות שסולקו או אחסן אותן בצינורות שחורים מלאים ב- CUBIC-R ב- RT למשך שבוע אחד.</li>
	</ol></li>
</ol>3. רכישת תמונות
<ol><li>הדמיה קונפוקלית הערה: דמיינו את דגימות הכליה החתוכות במיקרוסקופ קונפוקלי (עדשות: יעד Plan Apo λ 4×/0.2 N1 או יעד Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1). צלם תמונות גדולות (לדוגמה, 6052 מיקרומטר x 6052 מיקרומטר עבור פרוסת הכליה) עם ערימות z.<ol><li>הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ברצף הבא: כוח לייזר, מתג בקרה קונפוקלית, מחשב, מיקרוסקופ וחומרה קונפוקלית. לאחר הפעלת הבדיקה העצמית, הפעל את התוכנה הקונפוקלית.</li>
		<li>בחר את העדשה המתאימה. הסר את הדגימה מגיב CUBIC-R, הנח אותה בצלחת הקונפוקלית וכסה אותה כדי למנוע מהמגיב CUBIC-R להתייבש.</li>
		<li>הזז את הדגימה למרכז שדה הראייה וכוונן את מישור המוקד עד שהיא תהיה ממוקדת.</li>
		<li>החל שחזור תלת-ממדי (שלב 3.1.4.1) ושחזור תמונה גדולה (שלבים 3.1.4.2-3.1.4.3).<ol><li>שחזור תלת-ממדי (קונפוקלי): החלף את מישור הזום בכיוון אחד עד שלא תהיה פלואורסצנטיות גלויה; מיקום זה מוגדר כפסגה. לאחר מכן, החלף את מישור הזום בכיוון ההפוך עד שלא תיראה פלואורסצנטיות; מיקום זה מוגדר כתחתון. לחץ על לחצן הפעל בפינה השמאלית התחתונה של תיבת הדו-שיח כדי להתחיל בסריקה.</li>
			<li>שחזור תמונה גדול (קונפוקלי): הזיזו את שדה הראייה למרכז הדגימה וקבעו את המיקום הנוכחי כמרכז. בחר שדה ראייה של 2 x 2.</li>
			<li>בממשק הרב-תכליתי ND, בחרו באוסף Z כדי לבנות מחדש תמונות גדולות ולהגדיר אפשרויות שונות בחלונית. לאחר מכן לחץ על Run butto n כדי להתחיל בסריקה.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>הדמיית מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור (LSFM) הערה: דמיינו את כל הכליות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהיר (עדשה: EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (Medium n = 1.529) objective).<ol><li>צירוף דוגמאות (LSFM):<ol><li>הדביקו את הכליה השקופה למתאם קיבוע הדגימה והמתינו עד שהכליה מחוברת היטב.</li>
			<li>משרים את הכליה בפח הדגימה ודוחפים את סל הדגימה למערכת המיקרוסקופ. סגור את הצוהר.</li>
		</ol></li>
		<li>התבוננות וסריקה (LSFM):<ol><li>בממשק Locate יש להעביר את הדגימה לעמדת תצפית מתאימה. עבור לממשק הרכישה , הגדר את הנתיב האופטי, בחר לייזר 488 ננומטר, LBF 405/488/561/640, בלוק מסנן פיצול אופטי SBS LP 490, בחר מצלמה 2 ושנה את הצבע המדומה לירוק.</li>
			<li>מלא את ערך ההסטה Z שמאלי/ימני שהוקלט קודם לכן בתפריט המשנה 'ערוץ '. בחר את גודל התצוגה הקטן ביותר (0.36) וכוונן אותו לקבלת בהירות מרבית.</li>
		</ol></li>
		<li>מצא את גבול X\Y ואת טווח Z של האיבר כולו. התאם את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה (רצוי פחות מ- 10 אלפיות השנייה) ולחץ על הפעל כדי להתחיל.</li>
		<li>אם הרקמה גדולה מדי, מזג שתי תמונות או יותר עם תפירת תמונה. פתח את הקובץ שנלכד באמצעות תוכנת המיקרוסקופיה (כאן, ZEISS ZEN 3.7). בחר Processing > Method > Stitching > Method Parameter > Apply כדי להשלים את תפירת התמונה.</li>
	</ol></li>
</ol>4. עיבוד וכימות נתונים
הערה: עבד את ערימות התמונות באמצעות תוכנת Imaris (ניתוח תמונות), תוך שימוש בפונקציה Surface כדי לתייג את הגלומרולי ולבצע ניתוח.
<ol><li>רוזן גלומרולי<ol><li>ייבא תמונות גדולות (מיקרוסקופ קונפוקלי) או תמונות תפורות (מיקרוסקופ גיליון אור) לתוכנת ניתוח התמונות.</li>
		<li>פתח את הקבצים בתוכנת ניתוח התמונות. לחץ על לחצן Surface כדי ליצור משטח חדש. עקוב אחר המדריך בחלק השמאלי התחתון של המסך.<ol><li>לחץ על הלחצן הבא (לחצן חץ ימינה) מבלי לסמן דבר.</li>
			<li>סמן את התיבה לפני האפשרות החלקה והזן מספר מתאים (לדוגמה, 14.5) כדי לשלוט בפרטי המשטח. בחר חיסור רקע בסף ומלא את התיבה בקוטר הממוצע המשוער של הגלומרולי. לחץ על הלחצן הבא .</li>
			<li>התאם במידת הצורך ולחץ על הלחצן הבא . בחר בטווח המתאים ולחץ על הלחצן הבא ליצירת Surface.</li>
		</ol></li>
		<li>לחץ על סנן ולאחר מכן על לחצן הוסף כדי להוסיף כדוריות כדי לסנן אובייקטים שאינם כדוריים. לחץ על לחצן שכפל כדי להעתיק משטח חדש זה.</li>
		<li>לחץ/י על הכפתור ״סטטיסטיקה״ ולאחר מכן לחץ/י על הכפתור ״כולל ״; התוכנה תציג את מספר glomeruli כמספר הכולל של פני השטח.</li>
	</ol></li>
	<li>נפח של glomeruli<ol><li>צור משטח של glomeruli כמו לעיל.</li>
		<li>לאחר השלמת המשטח, לחצו על הלחצן 'בחירה ' לבחירת אובייקטי היעד ולהצגת עוצמת הקול של כל עצם. לחץ על הלחצן שמור וייצא נתונים סטטיסטיים לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף.</li>
	</ol></li>
	<li>נפח הפרוסה או הכליה כולה<ol><li>ייבא תמונות גדולות (מיקרוסקופ קונפוקלי) או תמונות תפורות (מיקרוסקופ גיליון אור) לתוכנת ניתוח התמונות.</li>
		<li>פתח קבצים בתוכנת ניתוח התמונות. לחץ על לחצן Surface כדי ליצור משטח חדש. עקוב אחר המדריך בחלק השמאלי התחתון של המסך.<ol><li>לחץ על הלחצן הבא (לחצן חץ ימינה) מבלי לתקתק.</li>
			<li>סמן את התיבה לפני האפשרות החלקה והזן מספר מתאים (לדוגמה, 50) כדי לשלוט בפרטי המשטח. בחר עוצמה מוחלטת בסף. לחץ על הלחצן הבא .</li>
			<li>התאם את המשטח עד שיכסה את כל הרקמה ולחץ על הלחצן הבא . לחץ על הלחצן הבא כדי ליצור את Surface.</li>
		</ol></li>
		<li>לחץ על הלחצן Selection כדי לבחור את פני השטח של הרקמה כולה ולהציג את עוצמת הקול של הרקמה. לחץ על לחצן שמור כדי לייצא נתונים סטטיסטיים לגיליון אלקטרוני.</li>
	</ol></li>
</ol>

תיוג פלואורסצנטי של גלומרולי בכליות עכבר מנוקות למיקרוסקופ

<ol>
	<li>Hoy, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+number,+glomerular+volume,+renal+disease+and+hypertension.">Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).</li><li>Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+nephron+number:+implications+for+health+and+disease.">Human nephron number: implications for health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).</li><li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age,+kidney+weight,+and+body+surface+in+normal+man.">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).</li><li>Rasch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+diabetic+glomerulopathy+in+streptozotocin+diabetic+rats+by+insulin+treatment.+Kidney+size+and+glomerular+volume.">Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume.</a> Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).</li><li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+number+and+size+variability+and+risk+for+kidney+disease.">Glomerular number and size variability and risk for kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).</li><li>Bertram, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+and+how+we+determine+nephron+number.">Why and how we determine nephron number.</a> Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).</li><li>Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+numbers+of+glomeruli+and+individual+glomerular+cell+types+in+the+normal+rat+kidney.">Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).</li><li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research.">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li><li>Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+renal+glomeruli+with+the+new+stereology.">Analyzing renal glomeruli with the new stereology.</a> International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).</li><li>L&#248;drup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+biopsies+can+be+used+for+estimations+of+glomerular+number+and+volume:+a+pig+study.">Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study.</a> Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).</li><li>Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+glomerular+volume:+a+comparison+of+four+methods.">Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods.</a> Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).</li><li>Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurements+of+kidney+glomerular+number+and+size+in+healthy+and+Os(/+)+mice+using+MRI.">In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cationic+near+infrared+fluorescent+agent+and+ethyl-cinnamate+tissue+clearing+protocol+for+vascular+staining+and+imaging.">A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).</li><li>Beeman, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+glomerular+number+and+size+in+perfused+kidneys+using+MRI.">Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).</li><li>Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+glomerular+number+in+situ+using+magnetic+resonance+imaging+and+biopsy.">Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy.</a> Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).</li><li>Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+molecular+imaging+of+the+kidney.">Label-free molecular imaging of the kidney.</a> Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).</li><li>Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+thick+and+thin+section+method+for+estimation+of+podocyte+number,+glomerular+volume,+and+glomerular+volume+per+podocyte+in+rat+kidney+with+Wilms'+tumor-1+protein+used+as+a+podocyte+nuclear+marker.">Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Lloyd-Lewis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+mammary+gland+and+mammary+tumours+in+3D:+optical+tissue+clearing+and+immunofluorescence+methods.">Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).</li><li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUBIC-plus:+An+optimized+method+for+rapid+tissue+clearing+and+decolorization.">CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CUBIC+tissue+clearing+for+whole-organ+cell+profiling.">Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).</li><li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=We+can+see+clearly+now:+optical+clearing+and+kidney+morphometrics.">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+combinations+of+fluorescent+vessel+labeling+and+tissue+clearing+methods+for+three-dimensional+visualization+of+vasculature.">Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature.</a> Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy.">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Bai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+vascular+network+labeling+method+for+transparent+tissues+of+mice.">A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice.</a> Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Kolesov&#225;, H., Olejn&#237;&#269;kov&#225;, V., Kvasilov&#225;, A., Gregorovi&#269;ov&#225;, M., Sedmera, D. J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+imaging+methods+for+cardiovascular+development.">Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development.</a> Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+technique:+Recent+progress+and+biomedical+applications.">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li><li>Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+CLARITY-based+tissue+clearing+and+imaging.">Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging.</a> Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).</li><li>Ert&#252;rk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cleared+intact+biological+systems+at+a+cellular+level+by+3DISCO.">Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).</li></ol>

כל המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

טכנולוגיות ניקוי רקמות ניתן לסווג 3 או 4 קבוצות 29,30,31. ניקוי רקמות אורגני מבוסס ממס (למשל, DISCO ופגסוס), ניקוי רקמות על בסיס מימי (למשל, CUBIC), וניקוי רקמות הטבעה הידרוג'ל (למשל, CLARITY) יושמו כולם בניקוי כליות 25,26,28,32.<s...

מספר ונפח glomeruli חשובים מאוד לאבחון וטיפול במחלות כליות שונות 1,2,3,4,5. תקן הזהב של הערכת מספר גלומרולי הוא שילוב הדיסקטור הפיזי / שבר. עם זאת, שיטה זו דורשת ריאגנטים מיוחדים וציוד, מה שהופך אותו איטי ויקר 6,7,8,9. ביופסיה מספקת שפע של מידע, אך ברור ששיטה זו מתאימה רק להערכות גסות10,11. טכנולוגיות הדמיה רפואית, כולל דימות תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה ממוחשבת (CT) ורנטגן, נמצאות בשימוש נרחב גם בזיהוי גלומרולרי 12,13,14,15, אך טכנולוגיות כאלה דורשות מכשירים מגושמים. שיטות חדשות, כגון ספקטרומטר מסה16 (MALDI) או שיטת חתך עבה ודק17, שימשו גם בזיהוי גלומרולרי, אם כי הן נותרו מייגעות ומייגעות.
בעזרת טכנולוגיות שקיפות ניתן להתבונן לעומקים עמוקים יותר ולקבל מידע עשיר ושלם יותר מרקמות עבות או אפילו איברים שלמים 18,19,20,21,22,23. לכן, טכנולוגיות שקיפות היו בשימוש נרחב במחקר כליות24. התצפית והזיהוי של glomeruli בכליות מנוקות מעורבים גם. עם זאת, מאמרים אלה שפורסמו התייחסו רק בקצרה לזיהוי גלומרולרי25 או השתמשו בשיטות תיוג קשות להשגה כגון חיות טרנסגניות26, צבעים בייצור עצמי13, או דגירה נוגדנים בריכוז גבוה27 כדי לתייג את הגלומרולי. בנוסף, למרות שמחקרים ניתחו גלומרולי בכליות מנוקות, הניתוחים היו תמיד מוגבלים13 או הסתמכו על אלגוריתמי ניתוח שהוקמו על ידי המחברים עצמם26.
הדגמנו בעבר דרך נוחה יותר לתייג את הגלומרולי בעכברים כליות28. על ידי שימוש ב- Imaris, מצאנו כי ספירת גלומרולי, תדירות ונפח ניתן להשיג במהירות. לכן, כאן אנו מציגים קבוצה נגישה, מקיפה ופשוטה יותר של שיטות כדי לתייג ולנתח את glomeruli של כליות עכברים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>7007171800</td>
			<td>Fixation reaagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>502 Glue&#160;</td>
			<td>Deli</td>
			<td>7146</td>
			<td>For fixing the kidney to the sample fixing adapter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antipyrine</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>A110660</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Matrix</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>1mm 40-75</td>
			<td>Tissue slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1plus</td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD150S</td>
			<td>Labeling reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light sheet fluorescence microscopy&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Light sheet 7&#160;</td>
			<td>Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>Ensiweier</td>
			<td></td>
			<td>Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25&#8211;30 g)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Butyldiethanolamine</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>B299095</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>N105042</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital Natriumsalz</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail vein fixator</td>
			<td>JINUOTAI</td>
			<td>JNT-FS35</td>
			<td>Fix the mouse for vail injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Clearing reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient and fast method for labeling and analyzing mouse glomeruli

הגלומרולי הן יחידות בסיסיות בכליה; לפיכך, לימוד הגלומרולי הוא חיוני להבנת תפקוד הכליות והפתולוגיה. הדמיה ביולוגית מספקת מידע אינטואיטיבי; לכן, יש משמעות רבה לתייג ולהתבונן גלומרולי. עם זאת, שיטות התצפית הגלומרוליות הנמצאות בשימוש כיום דורשות פעולות מסובכות, והתוצאות עלולות לאבד פרטי תווית או מידע תלת מימדי (תלת ממדי). הקוקטיילים הצלולים והבלתי מופרעים של דימות מוחי וניתוח חישובי (CUBIC) של טכנולוגיית ניקוי רקמות נמצאים בשימוש נרחב במחקר הכליות, ומאפשרים זיהוי מדויק יותר ועומק גילוי עמוק יותר. מצאנו כי גלומרולי עכבר יכול להיות מסומן במהירות וביעילות על ידי הזרקת ורידים זנב של משקל מולקולרי בינוני FITC-Dextran ואחריו שיטת ניקוי CUBIC. ניתן לסרוק את כליה העכבר המנוקה על ידי מיקרוסקופ אור (או מיקרוסקופ קונפוקלי כאשר פורסים) כדי לקבל ערימות תמונה תלת ממדיות של כל הגלומרולי בכליה כולה. מעובד עם תוכנה מתאימה, אותות glomeruli יכול להיות דיגיטלי בקלות ולנתח עוד יותר כדי למדוד את מספר, נפח, ותדירות של glomeruli.

The number and volume of glomeruli are very important for the diagnosis and treatment of various kidney diseases1,2,3,4,5. The golden standard of glomeruli number estimation is the physical dissector/fractionator combination. However, this method requires special reagents and equipment, making it slow and expensive6,7,8,9. Biopsy provides a wealth of information, but obviously, this method is only suitable for rough estimations10,11. Medical imaging technologies, including magnetic resonance imaging (MRI), computed tomography (CT), and X-ray, are also widely used in glomerular detection12,13,14,15, but such technologies require bulky instruments. New methods, such as matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometer16 or the thick and thin section method17, have also been used in glomerular detection, though they remain tedious and laborious.
With the help of transparency technologies, it is possible to observe deeper depths and obtain richer and more complete information from thick tissues or even whole organs18,19,20,21,22,23. Therefore, transparency technologies have been widely used in kidney research24. The observation and detection of glomeruli in the cleared kidneys are also involved. However, these published articles either only briefly referred to glomerular detection25 or used difficult-to-achieve labeling methods such as transgenic animals26, self-produced dyes13, or high-concentration antibody incubation27 to label the glomeruli. In addition, although studies had analyzed glomeruli in cleared kidneys, the analyses were always limited13 or relied on analysis algorithms established by the authors themselves26.
We have previously demonstrated a more convenient way to label the glomeruli in mice kidneys28. By using Imaris, we found that glomeruli count, frequency, and volume could be quickly obtained. Thus, here we present a more accessible, comprehensive, and simplified set of methods to label and analyze the glomeruli of mice kidneys.

מחבר זרקור: סיוע למחקר בביולוגיה של הכליות על ידי תיוג גלומרולי ברקמות מנוקות 

שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר

Labeling and counting glomeruli using conventional methods can be complicated, tedious, time consuming, and bulky instrument are required. Our method offers an instant and intuitively accurate labeling method for analysis of the glomeruli within the entire kidney. Our technique is a quick, easy, accurate, and cheap method to analyze glomeruli in the entire kidney.It does not require any special equipment, so it can be carried out in any laboratory. This is a groundbreaking, rapid, and simple method to label glomeruli, allowing for an intuitive observation of all the glomeruli within the entire kidney. It holds great potential to assist researchers to make significant breakthroughs in the study of the kidney by providing information such as glomeruli quantity, volume, distribution, and more.On one hand, we're exploring the application of this glomeruli labeling method in clinical kidney disease research. On the other hand, we'll keep working on enhancing methods to label biotargets like blood vessels or specific proteins in transparent tissues, adjusting them to meet our research needs.

מחקר זה מספק שיטה פשוטה ויעילה לתיוג וניתוח הגלומרולי בכליות עכברים.
Glomeruli (כלי דם) יכול להיות מסומן היטב על ידי הזרקת כלי דם FITC-Dextran. לאחר תהליך הניקוי הכליה נעשתה שקופה (איור 1A), וניתן היה לראות בבירור את הגלומרולי באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור (איו...

Watch this Scientific Journal Video about Aiding Research in Kidney Biology by Labeling Glomeruli in Cleared Tissues at JoVE.com

מחקר זה מציג מערך קל לשימוש, שלם ופשוט של שיטות לתייג ולנתח גלומרולי מכליות עכבר שעברו ניקוי מעוקב. נתונים כגון מספר גלומרולוס ונפח ניתן להשיג בקלות ובאמינות באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM), או מיקרוסקופ קונפוקלי נפוץ ותוכנה כגון Imaris.

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...

תיוג וספירה glomeruli בשיטות קונבנציונליות יכול להיות מסובך, מייגע, זמן רב, מכשיר מגושם נדרשים. השיטה שלנו מציעה שיטת תיוג מיידית ומדויקת אינטואיטיבית לניתוח של glomeruli בתוך הכליה כולה. הטכניקה שלנו היא שיטה מהירה, קלה, מדויקת וזולה לניתוח גלומרולי בכל הכליה.זה לא דורש שום ציוד מיוחד, ולכן זה יכול להתבצע בכל מעבדה. זוהי שיטה פורצת דרך, מהירה ופשוטה לתייג גלומרולי, המאפשרת התבוננות אינטואיטיבית בכל הגלומרולי בתוך הכליה כולה. הוא טומן בחובו פוטנציאל רב לסייע לחוקרים לבצע פריצות דרך משמעותיות בחקר הכליה על ידי מתן מידע כגון כמות גלומרולי, נפח, פיזור ועוד.מצד אחד, אנו בוחנים את היישום של שיטת תיוג גלומרולי זו במחקר קליני של מחלות כליות. מצד שני, נמשיך לעבוד על שיטות שיפור לסימון מטרות ביולוגיות כמו כלי דם או חלבונים ספציפיים ברקמות שקופות, ונתאים אותן לצרכי המחקר שלנו.

an-efficient-fast-method-for-labeling-analyzing-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

729 Views.  Sichuan University. תיוג וספירה glomeruli בשיטות קונבנציונליות יכול להיות מסובך, מייגע, זמן רב, מכשיר מגושם נדרשים. השיטה שלנו מציעה שיטת תיוג מיידית ומדויקת אינטואיטיבית לניתוח של glomeruli בתוך הכליה כולה. הטכניקה שלנו היא שיטה מהירה, קלה, מדויקת וזולה לניתוח גלומרולי בכל הכליה.זה לא דורש שום ציו?...

Video: מחבר זרקור: סיוע למחקר בביולוגיה של הכליות על ידי תיוג גלומרולי ברקמות מנוקות 

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological imaging provides intuitive information; thus, it is of great significance to label and observe the glomeruli. However, the glomeruli observation methods currently in use require complicated operations, and the results may lose label details or three-dimensional (3D) information. The clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis (CUBIC) tissue clearing technology has been widely used in renal research, allowing for more accurate detection and deeper detection depth. We found that mouse glomeruli can be rapidly and effectively labeled by tail vein injection of medium molecular weight FITC-Dextran followed by the CUBIC clearing method. The cleared mouse kidney could be scanned by a light-sheet microscope (or a confocal microscope when sliced) to obtain three-dimensional image stacks of all the glomeruli in the entire kidney. Processed with appropriate software, the glomeruli signals could be easily digitized and further analyzed to measure the number, volume, and frequency of the glomeruli.

This study presents an easy-to-use, complete, and simple set of methods to label and analyze glomeruli from CUBIC-cleared mouse kidneys. Data such as glomerulus number and volume can be obtained easily and reliably using fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence microscopy (LSFM), or common confocal microscopy and software such as Imaris.