פרוטוקול זה הוא כלי שימושי מאוד להערכת רעילות כללית ראשונית על סוגים שונים של דגימות, כגון תמציות, שברים ותרכובות ממקורות טבעיים או סינתטיים שונים. היתרון העיקרי של הפרוטוקול שלנו הוא שהוא קל מאוד וזול וניתן להשתמש בו על דגימות רבות בו זמנית. יתר על כן, ציוד בעבודת יד משפר את האמינות של האתר.
בשלב טכניקה זו, אנו מבצעים סינון לבחירת הדגימות על סמך פרופיל הרעילות הכללי הראשוני שלהן שיעבור בדיקות ספציפיות נוספות, כגון קווי תאים נרחבים או אפילו בדיקות in-vivo. שיטה זו מנוצלת בעיקר בתחומי הכימיה של תרופות ומוצרים אחרים לסינון דגימות ביוטיות. הפרוטוקול שלנו יכול לשמש גם לסוגים אחרים של דגימות כגון ננו-מערכות.
בעת ביצוע בפעם הראשונה, להיות סבלני כי זה צריך מיומנויות תצפית עדינות והרבה תשומת לב לכל הפרמטרים דיווחו מרשה פיליפה וורה איסקה, תלמידי הדוקטורט מהמעבדה שלנו יעזרו להדגים את ההליך הזה. התחל על ידי הצבת מיכל בצורת משפך בתמיכה השחורה וסיבוב המשפך בכיוון מתאים כדי לראות את סימן הרמה ואת הברז. כדי להפוך את ציוד ההגירה בעבודת יד לחתוך את החלק העליון של שני בקבוקי פלסטיק 0.5 ליטר כדי לקבל גובה סופי של 12 ס"מ.
צרו חור בקוטר 1.5 ס"מ בצד אחד ושבעה סנטימטרים מתחתית כל בקבוק והכניסו צינור גומי באורך 13 ס"מ בין שני הפתחים. אטמו את הפתחים בדבק חם והשאירו אותם להתייבש במשך 15 דקות. שים את הבקבוקים על משטח שטוח ומלא אותם במים כדי לוודא שאין נזילה.
הוסיפו 28 גרם מלח ל-800 מיליליטר מי ברז כדי להכין את תמיסת המלח המלאכותית, או מלח שרימפס בריכוז של 35 גרם לליטר. מערבבים אותו עם מוט ערבוב עד שכל המלח מומס היטב. כדי להכין את הדגימות להמיס כמות מתאימה של כל תמצית תרכובת dimethylsulfoxide, או DMSO, בריכוז סופי של 10 מיליגרם למיליליטר.
לאחר מכן דלל 10 מיקרוליטרים מכל דגימה בצינור מיקרו צנטריפוגה חדש באמצעות 990 מיקרוליטרים של תמיסת המלח המלאכותית כדי להשיג ריכוז סופי של 0.1 מיליגרם למיליליטר. מתחת למכסה אדים בבקבוק ארלנמאייר, הכינו תמיסה של אשלגן דיכרומט במים מזוקקים בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר. ממלאים את כלי הבקיעה במדיום עד 500 מיליליטר ומוסיפים כף אחת, או כ -0.5 גרם של ציסטות שרימפס מלח לתמיסת המלח.
סגור את המיכל. הניחו מנורה המכוונת ישירות לכיוון הציוד והפעילו אותה. חבר את מערכת ספק האוויר למחבר המונח על גבי הציוד והפעל את המשאבה.
ציסטות שרימפס תמלחת בוקעות בתמיסת המלח המלאכותית תחת אוורור נמרץ, תאורה רציפה וטמפרטורה יציבה. לאחר 24 עד 48 שעות, כאשר הביצים בקעו, כבו את משאבת האוויר והמתינו עד שהנאופליי יופרדו ממארזי הביצים הריקות. כדי להפריד את הביצים שלא נקטעו מהנאופליי החי, פתחו את ברז היציאה בתחתית ופרקו את תוכן המשפך באחת המכולות של מיכל ציוד הנדידה בעבודת יד.
ודא שהתמיסה המכילה את הנאופליי ואת שאריות הביצים שלא בקעו נמצאת מתחת לגובה הצינור. מניחים את הציוד באינקובטור במשך ארבע שעות, ולאחר מכן במיכל השני להוסיף את תמיסת מלח שיורית מעל גובה הצינור. מכסים את המיכל עם nauplii ואת שאריות ביצים unhatched באמצעות רדיד אלומיניום ומניחים את המנורה על המיכל השני רק עם תמיסת מלח.
חסילוני המלח יימשכו על ידי האור ויעברו ממיכל אחד למשנהו, מה שיוביל להפרדה יעילה בין ביצים לארטמיה חיה. ממיכל הקציר, לאסוף 900 microliters של תמיסת מלח המכיל 10 עד 15 nauplii ומניחים את התמיסה בבאר אחת של צלחת 24 באר. כל הדגימות נבדקות ברביעיות.
הוסף 100 מיקרוליטר של כל שליטה שלילית. שליטה חיובית, תמיסת המלח המלאכותית, וכל אחת מהדגימות לבארות ודגירה של הצלחת תחת תאורה למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, רשום את מספר הזחלים המתים בכל באר תחת מיקרוסקופ דו-עיני בהגדלה של 12 x.
הוסף 100 microliters של תמיסת אשלגן דיכרומט כדי לגרום למוות של הזחלים החיים הנותרים ולחכות שש שעות. ספרו את סך הזחלים המתים בכל באר תחת מיקרוסקופ וקבעו את שיעור התמותה בהתאם למשוואה המוצגת על המסך. בצע את כל הבדיקות במשולשים וחשב את סטיות התקן.
לבסוף, הביעו את התוצאות כממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים שכל אחד מהם עם ריבועים פנימיים פלוס, מינוס סטיות תקן. המבנה של התרכובות הנבחרות שהופקו ממיני Plectranthus והתקבלו על ידי סינתזה למחצה מוצגים באיור זה. נאופליי חדש של ארטמיה סלינה כפי שנראה מתחת למיקרוסקופ מוצג בתמונה זו.
תמונה גרפית זו מייצגת את שיעור התמותה של ארטמיה סלינה לאחר 24 שעות של חשיפה לארבע תמציות מתנול של מיני פלקטרנתוס ב 0.1 מיליגרם למיליליטר. כל התמציות היו מקובלות מבחינת רעילות כללית באמצעות בדיקה זו. כאן מלח מתאים תמיסת מלח או ריק.
אשלגן דיכרומט שימש כבקרה חיובית ו- DMSO שימש כבקרה שלילית. כל התמציות שנבדקו הראו תוצאות מעודדות מאוד עם ערכים נמוכים מאוד של אחוזי תמותה דומים לאלה שנרשמו עבור הריק והבקרה השלילית. שיעור התמותה של ארטמיה סלינה לאחר 24 שעות של חשיפה לחמש תרכובות טהורות ב 0.1 מיליגרם למיליליטר מוצג בנתון זה.
מנתונים אלה, ניכר כי רק חמישה מראה רעילות מינימלית באמצעות בדיקה זו אתה צריך לזכור שלושה שלבים בפרט, בקיעה, נדידה ואיסוף. כתוצאה מכך, יש לנו שרימפס אחרים מופרדים והמספרים לעבוד איתם. האתר הראשוני הוא רעילות ערוץ מודל פשוטה וזולה בהשוואה לאתרים אחרים כמו תרבית תאים או דגי זברה.
יתר על כן, אתרי ציטוטוקסיות יקרים יותר יכולים להיות מנוצלים.
