מיני Plantago יכולים לשמש כצמחי מודל לביולוגיה של כלי הדם של צמחים ולפיזיולוגיה של עקה. קביעת פרוטוקול טרנספורמציה מאפשרת מחקרים מעמיקים על צמחים אלה לחקור את היחסים בין גנים לבין הפנוטיפ הקשור אליהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת במזונות כמו explants כדי להפוך plantain צר עם יעילות גבוהה.
כדי להתחיל, מניחים זרעי בר מסוג Plantago lanceolata הזמינים מסחרית בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר עד לסימן 5 מיליליטר, בהתאם למספר הצמחים הרצוי. טבלו את הזרעים באתנול 75% למשך 60 שניות. לאחר השלכת האתנול, לטבול את הזרעים בהיפוכלוריט 20% נתרן טרי מוכן במשך 40 דקות על ידי היפוך עדין של הצינור.
תחת מכסה מנוע זרימה למינציה, להשליך את תמיסת hypochlorite נתרן, ולאחר מכן לשטוף את הזרעים חמש פעמים עם מים מזוקקים. הוסיפו כמות קטנה של מים לזרעים לאחר השטיפה הסופית, מכיוון שזה יכול לעזור לתנועה של הצמחים על הצלחות. בעזרת מלקחיים סטריליים, מעבירים את הזרעים לצלחת פטרי מוכנה מראש עם מדיום MS מוצק על ידי פיזור הזרעים באופן שווה על פני הצלחת, כסנטימטר אחד בין כל זרע כדי למנוע צפיפות יתר של השתילים הנובטים.
אוטמים את הצלחת בשתי שכבות של סרט פרפין למניעת זיהום ודגרים תחת אור גידול לבן וקריר בטמפרטורת החדר. ברגע שהשתילים נובטים והם גדולים מספיק כדי להעביר, בדרך כלל לאחר יומיים או שלושה של נביטה, השתמשו במלקחיים סטריליים והעבירו את השתילים לקופסאות סטריליות המכילות 50 עד 100 מיליליטר של MS Medium. אטמו את הקופסאות בסרט כירורגי, ואפשרו לצמחים לגדול תחת אור הגידול הלבן והקריר במשך כשלושה עד ארבעה שבועות.
פס Agrobacterium tumefaciens המכיל את הפלסמיד הרצוי על צלחת LB מוצק מוכן עם סוכן הבחירה המתאים. דוגרים על הצלחת האטומה בפרפין בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך עד 48 שעות, או עד שהחיידקים גדלים מספיק כדי לקטוף. לאחר הדגירה, בוחרים מושבת חיידקים באמצעות קצה פיפטה יומיים לפני הטרנספורמציה, ומחסנים אותה בצינור תחתון עגול של 15 מיליליטר המכיל שישה מיליליטר של LB נוזלי עם חומר הבחירה המתאים.
נערו במהירות של 200 סל"ד בשייקר שולחני של 28 מעלות צלזיוס, למשך הלילה, עד שה-OD 600 יגיע ל-0.6 עד 0.7. ברגע שהחיידקים מגיעים ל-OD הנדרש, מעבירים 200 מיקרוליטר של תרבית החיידקים לבקבוק סטרילי המכיל 100 מיליליטר LB עם חומר הבחירה. נערו ב-200 סל"ד ב-28 מעלות צלזיוס, למשך הלילה.
לאחר מכן להעביר את תרבית החיידקים לתוך צינורות צנטריפוגות סטריליות 50 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 2, 200G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את החיידקים. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית החיידקים בחמישה מיליליטר של תמיסת תרחיף טרייה או SS בטמפרטורת החדר על ידי פיפט. לאחר מכן מוסיפים עוד SS עד לסימן 50 מיליליטר והופכים לערבוב מספר פעמים.
לאחר שהצמחים מגיעים לשלב האידיאלי לטרנספורמציה, תוך כשלושה שבועות, השתמשו במלקחיים ובמספריים סטריליים כדי להפריד את השורשים מהצמח ולהשליך את חומר העלה והגבעול. מיד לאחר החיתוך, מעבירים את חתיכות השורש לקופסאות המכילות מים סטריליים באמצעות מלקחיים כדי לשמור עליהם רוויים. לאחר מכן, שפכו את תרבית החיידקים Agrobacterium tumefaciens התלויה של האס אס לתוך צלחות פטרי חד פעמיות סטריליות בגודל 150 על 15 מילימטר.
מעבירים את השורשים החתוכים לתרבית החיידקים ודגרים במשך 20 דקות לפחות. במהלך הדגירה, השתמש באזמל סטרילי עם להב חד כדי לחתוך את השורשים לשברים של סנטימטר אחד המפרידים בין השורשים הראשוניים לשורשים הרוחביים. לאחר מכן בצעו חתכים רדודים דקים על פני השטח של השורשים כדי לאפשר לחיידקים להדביק את הצמח.
לאחר הדגירה, מעבירים את חתיכות השורש למגבות נייר סטריליות כדי להסיר עודפי חיידקים. לאחר מכן מעבירים את השורשים המיובשים לצלחות פטרי מוכנות המכילות מצע מוצק של תרבית משותפת בסביבות 10 עד 20 שורשים בכל צלחת, תלוי בגודל השורשים. אוטמים את הצלחות בשתי שכבות של סרט פלסטיק שקוף ולאחר מכן ברדיד אלומיניום כדי לדגור בטמפרטורת החדר במשך שלושה ימים.
לאחר שלושה ימי דגירה. במדיה של תרבית משותפת, העבירו את חתיכות השורש לצלחות פטרי מוכנות עם מדיה אינדוקציה של יורה מוצק או סים עם 500 מיליגרם לליטר טמטין ובחירה אנטיביוטית מתאימה. דוגרים על לוחות אטומים של סרט פלסטיק שקוף תחת אור גידול למשך חודש או עד שהנבטים מתחילים לצאת.
פעם הצמחים גדלים 1.5 עד 2.0 ס"מ אורך. מעבירים אותם לקופסאות סטריליות מוכנות. עם מדיה אינדוקציה שורש מוצק.
מגדלים את הצמחים תחת אור גידול במשך מספר שבועות עד להיווצרות שורשים. בדרך כלל, לאחר שבוע, כאשר מערכות השורשים הופכות גדולות מספיק כדי לעבור בדרך כלל לאחר חודש של צמיחה לקחת את הצמח בעדינות לשטוף את השורשים עם מים כדי להסיר כל מדיום שנדבק לשורשים. לאחר מכן מעבירים את הצמחים לעציצים מרובעים בגודל 3.5 אינץ' המכילים אדמה רב-תכליתית רטובה מראש, BM שבע מכסים את הצמחים בכיסוי עציץ פלסטיק ולאחר מכן בשקית ניילון שקופה כדי להבטיח שהצמחים יישארו בסביבה לחה.
שיטה זו נבדקה על עלה השורש ועל רקמה ישנה קטנונית. בניסוי הראשוני, למרות שניתן היה לגרום לקשקשים בכל סוגי הרקמות, רק רקמת השורש הפיקה ראשי תיבות לאחר חודש ב-SIM, העלה והדוושה הפכו חומים ומתים. ההתקדמות של ראשי תיבות יורים היוצאים מרקמה שעברה טרנספורמציה נצפתה מהיום הראשון.
השורשים הונחו על הסים לזמן שבו הנבטים היו מוכנים להשתרש. לאחר שבוע, רקמת השורש יצרה קשקוש בתחילת ראשי התיבות של יורה ניתן היה לראות. הנבטים המשיכו לצוץ במהלך השבועות השני והשלישי ולאחר ארבעה שבועות, הנבטים היו מוכנים להעברה למדיום השראת השורש.
זיהוי הצמחים המהונדסים-עונשיים בוצע באמצעות בדיקת בטא גלוקורונידאז GUS היסטוכימית באמצעות מקטעי העלים שנלקחו לאחר שהנבטים היו באורך של כ-0.5 סנטימטרים. הכתב הפראי בטרנספורמציה עם וקטורים ריקים אינו מציג תבנית צביעה. בשל היעדר הגן GUS, השינוי עם הגן GUS בטא glucuronidase הראה דפוס כתמים כחול ברור בוורידים המאשר כי הצמחים הם טרנסגניים שורשים תמיד צריך להישמר hydrated כדי למנוע התייבשות במהלך ההליך להעביר את השורשים כ 10 בכל פעם כדי למנוע זאת.
