תפרחות צעירות כמו explant לייצור callus חשובים לביסוס טרנספורמציה גנים מהירה ויעילה ושיטת התחדשות לחשיפת תפקוד הגנים, כמו גם לשיפור היבול. תפרחות צעירות כמו explant לייצור callus חשובים לביסוס טרנספורמציה גנים מהירה ויעילה ואת שיטת ההתחדשות לחשיפת תפקוד הגנים. הדגמת וידאו של טכניקה זו תסייע לצופה להבין את תהליך השמירה על החומרים כדי לייצר את היישור הטרנסגני הרצוי מבלי לבזבז זמן ומאמץ.
התחל על ידי איסוף תפרחות אורז צעירות מהשדה אורז או חממה בשלב meiosis, לוודא שהם מכוסים נדן עלה. מנגבים כל תפרחת עם ספוגית של 70% אלכוהול ותנו לה להתייבש לפני החיתוך. מביאים את תפרחת לספסל מעבדה סטרילי וחותכים אותו לחתיכות קטנות עם מספריים מעוקרים, ואז מעבירים את החתכים לצלחת פטרי המכילה מדיום NBD2.
הדגירה את הצלחת בחושך ב 26 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 14 ימים כדי לגרום קאלוס. כדי לבצע טרנספורמציה, להעביר מושבה אחת מצלחת EB לבן עם אנטיביוטיקה סלקטיבית לחמישה מיליליטר של מדיום YEB נוזלי המכיל את אותה אנטיביוטיקה במבחנה סטרילית חרוטית 50 מיליליטר. לנער את הצינור על שייקר מסלולית ב 250 פעמים g ו 25 כדי 28 מעלות צלזיוס עד חיידקים לגדול OD 600 של 0.5.
הוסף מיליליטר אחד של השעיה חיידקית ל 100 מיליליטר של מדיום YEB עם אותה אנטיביוטיקה סלקטיבית בבקבוק חרוט 250 מיליליטר לנער את הבקבוק על שייקר מסלולית ב 250 פעמים g ו 28 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. צנטריפוגה התרבות ב 4, 000 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את החיידקים. השלך את supernatant ו resuspend את גלולה עם AAM כבינוני, ולאחר מכן לדלל את ההשעיה ל OD 600 של 0.4.
לאחר הדגירה, לאסוף סביב 150 קאלי עוברי צהוב בהיר בריא לתוך בקבוק סטרילי 150 מיליליטר. הוסף 50 עד 75 מיליליטר של ההשעיה תא חיידקי לתוך הבקבוק ולאחר מכן להוסיף 10 עד 25 מיליליטר של טרי AAM כבינוני לטבול את קאלי במשך 10 עד 20 דקות, רועד מדי פעם. יוצקים את ההשעיה החיידקית מתוך הבקבוק בזהירות ומייבשים את הקאלי בנייר מסנן סטרילי, ואז מניחים אותם על צלחת פטרי עם NBD AS בינוני ומכסים אותם בנייר סינון.
דגירה קאלי ב 25 עד 28 מעלות צלזיוס בחושך במשך שלושה ימים, בדיקת אותם עבור צמיחת יתר חיידקית. לאחר שלושה ימים של טיפוח שותף, מעבירים את הקאלי לצלחת פטרי סטרילית באמצעות נייר סינון, ואז מייבשים אותם באוויר במשך שעתיים על ספסל נקי. ודא שהקאלי אינם דבקים בנייר הסינון והעבר אותם לבינונית הבחירה הראשית NBD2.
לאחר שבועיים, להעביר את קאלי באופן שווה לצלחת חדשה המכילה מדיום בחירה טרי, ולאחר מכן להעביר את קאלי למדיום טרשת נפוצה טרי עבור בידול ואת ניצני לירות למדיום MS עם 10 מיליגרם לליטר Hygromycin להתרבות יורה יותר. העבר את היורה החדש לתוך חצי MS בינוני עבור אינדוקציה שורש ותרבות אותם תחת אור ב 25 עד 28 מעלות צלזיוס. הצמחים שהשתנו צריכים לייצר שורשים בתוך שבועיים.
כדי לבצע תצפית פנוטיפ הרבייה, להסיר את פלאה ולמה מן הפרחוני ותמונה anthers כולו תחת מיקרוסקופ סטריאו. כדי לבחון את הכדאיות אבקה, לבחור קוצים אורז בוגרת לפני אנתזת הפרח ולהסיר את פלאה ו lemma לשחרר את anthers. קח שישה אנתרים והצב אותם על מגלשת זכוכית.
מוסיפים טיפה אחת של מים מזוקקים, מוחצים את האנטר עם פינצטה כדי לשחרר את גרגרי האבקה, ואז מוסיפים שתיים עד שלוש טיפות של תווי יוד ומכסים בכיסוי. שים לב לשקופית תחת מיקרוסקופ הגדלה נמוכה. גרגרי אבקה צבועים בשחור מראים כדאיות נמרצת יותר בעוד דגנים ללא צבע או אלה צבועים חום צהוב הם ננסיים או מנוונים.
כדי לבצע מיקרוסקופיה חתוכת רוחבית, השתמש בתותב כחול 0.5% toluidine כדי להכתים את השקופיות במשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם במים ולייבש אותם במכסה המנוע אדים. לאחר ייבוש, לאטום את השקופיות עם דבק עץ ניטרלי, בעדינות למקם כיסוי על השקופית ולייבש אותם ברדס אדים, ואז תמונה המדגם תחת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה שימש ליצירת קו סטרילי זכר על ידי טרנספורמציה גנטית מתווך אגרובקטריום באורז.
הקאלי העוברי שימש ישירות לשינוי או תת-תרבות להתרבות כדי להשיג יותר קאלי לזיהום נוסף. לאחר טיפוח שותף במשך 48 שעות, הקאלי הועברו לסיבוב שני של מדיום בחירה. לאחר 10 עד 14 ימים, הפך קאלי הראה microcalli שזה עתה נוצר בעוד קאלי untransformed הפך חום ומת.
מאוחר יותר, קאלי בצבע בריא וקרמי הועברו למדיום התחדשות. הקאלי שהשתנתה הראתה בהדרגה כתמים ירוקים. כתמים ירוקים אלה היו מתורבתים במדיום התחדשות כדי לאפשר צמיחה לירות ולאחר מכן עבר חצי מדיום MS כדי לגרום לשורשים.
מאוחר יותר נקצרו יריות גידול בריאות ונמרצות עם שורשים מפותחים. בסך הכל הושגו 21 שתילים מחדש. הגברה PCR עבור אזור Hygromycin הראה כי תדירות הטרנספורמציה היה כ 85.71%the transformants היו genotyped לזהות את המוטציות באתרי היעד sgRNA.
בין 18 הצמחים המהודקים, שמונה קווים הטרוזיגים ושלושה קווים הומוזיגים היו CRISPR CAS9 חיובי. מוטנטים נוקאאוט הומוזיגוס אומתו על ידי התבוננות בסיסית איברי הרבייה הגבריים. אנת'רים של osabcg15 היו קטנים יותר חיוורים יותר מאלה של סוג הבר וחסר גרגרי אבקה בוגרת.
מיקרוסקופיה חתך רוחבי בוצעה כדי לחקור את הפגמים מורפולוגיים אנתר ב osabcg15. בשלב 10, מיקרוספורים מסוג פראי הפכו עגולים בצורתם ו vacuolated עם exine מוכתם כחול כהה. לעומת זאת, המיקרו-ספרוס של osabcg15 התמוטט והתדרדר.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, חשוב לוודא כי החומר שנאסף נמצא בשלב meiosis ולשלוט על זמן יובש האוויר של קאלי.
