הפרוטוקול המוצג הוא שיטה גמישה ביותר למניפולציה גנומית באובידוקט העכבר. זה מאפשר היווצרות של תאים מוטציה ספורדית מוקף תאים לא ערוכים בתוך סביבה immunocompetent. זה יתרון לחקור את התחלת הסרטן.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יכולת ההסתגלות הגבוהה שלה במיקוד איבר, אזור, אזור או סוג תא של עניין עם קבוצות ניתנות להחלפה בקלות של שילובי מוטציות, כל זאת ללא צורך מוחלט בקו עכבר. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות לשימוש באיברים עם לומן, כמו גם parenchyma איברים. כדי להתחיל, משוך צינור נימי זכוכית לנקודה חדה באמצעות מושך מיקרופיפטה.
בעזרת זוג מלקחיים מחודדים בעלי קצה דק במיוחד, חותכים את הקצה המחודד של צינור הנימים המשוך תחת מיקרוסקופ מנתח ליצירת פתח. ודא שהפתח אינו גדול מדי, מכיוון שהוא יפגע באובידוקט וימנע הזרקה איטית. לאחר מכן, סדרו את ציוד הניתוח הסטרילי, המיקרוסקופ, המיקרומניפולטור והאלקטרופורטור על ספסל נקי וסטרילי או בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.
חממו את כרית החימום על דיסק והניחו אותה מתחת לכלוב נקי ומאובזר. יוצקים 1X PBS סטרילי לתוך צלחת פטרי. בעזרת זוג מספריים נקיים, חותכים את נייר הספיגה לריבועים של אחד על סנטימטר.
זרוק אותם לתוך PBS כדי להשרות אותם. לאחר מכן, חבר את מחט נימי משוך מיקרומניפולטור מהדק, מיוצב על ידי הר מגנטי. פיפטה שני מיקרוליטרים של תמיסת ההזרקה על צלחת פטרי סטרילית.
תוך כדי התבוננות מתחת למיקרוסקופ, קחו לאט מיקרוליטר אחד עד שניים של תמיסת ההזרקה לתוך מחט המיקרו-הזרקה באמצעות מזרק בלחץ אוויר המחובר למיקרומניפולטור. הימנע לוקח בועות במחט. לאחר הרדמת עכברה בת שישה עד שמונה שבועות ומתן קרפרופן תת עורית, הניחו את העכבר על נייר סופג מחומם כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה.
יש למרוח חומר סיכה לעיניים על כל עין כדי למנוע התייבשות במהלך הניתוח. לאחר אישור מעצר ההרדמה על ידי צביטת הבוהן עם זוג מלקחיים, להסיר את הפרווה הגבית סביב אתר החתך הפוטנציאלי ולנגב את העור החשוף עם חיטוי. השתמשו בזוג מלקחיים ישרים וקהים כדי לצבוט את העור החשוף וליצור חתך באורך סנטימטר אחד לאורך קו האמצע של הגוף באמצעות זוג מספריים סטריליים.
צבטו והחזיקו צד אחד של אתר החיתוך באמצעות זוג מלקחיים סטריליים של אדסון. לאחר מכן, באמצעות זוג מלקחיים סטריליים, מעוקלים ומשוננים, מפרידים בעדינות את העור מדופן הגוף, מתחילים בחתך קו האמצע ונעים לרוחב. לאחר איתור כרית השומן מתחת לכליה, השתמשו בזוג מלקחיים סטריליים, ישרים וקהים כדי לצבוט את דופן הגוף ישירות מעל כרית השומן.
יוצרים חתך קטן בדופן הגוף בעזרת זוג מספריים סטריליים, חדים ומחודדים, תוך הקפדה על הימנעות מכלי דם. תוך כדי צביטת דופן הגוף במלקחיים ישרים וקהים, מכניסים לתוך החתך זוג מלקחיים סטריליים, קהים ומעוקלים ומרחיבים את החתך שנוצר בדופן הגוף. תפסו את כרית השומן הנראית לעין עם המלקחיים הקהה, המעוקלת, ומשכו אותה מהחור כדי לחשוף את השחלה, האובידוקט והרחם.
שמור על מסלול הרבייה חשוף על ידי הידוק כרית השומן עם מהדק בולדוג סטרילי. בזהירות מניחים את העכבר מורדם עם מסלול הרבייה חשוף על הבמה של מיקרוסקופ ניתוח. התאם את המיקרומניפולטור כך שמחט ההזרקה עם התמיסה נצפתה מתחת למיקרוסקופ.
לאחר מכן תמרן את המיקרוסקופ כדי להתבונן בקלות בשחלה, באובידוקט וברחם. בעזרת זוג מלקחיים סטריליים, מחודדים ובעלי קצה דק במיוחד, החזיקו את אזור האובידוקט להזרקה. האזור חייב להתיישר עם כיוון מחט המיקרו-הזרקה.
התאם את המיקרומניפולטור כדי לנקב את האובידוקט עם מחט המיקרו-הזרקה, ובו זמנית להזין את האובידוקט על המחט באמצעות המלקחיים המחודדים והעדינים במיוחד. הזז בעדינות את מחט המיקרו-הזרקה כדי לאשר שהיא הוכנסה לתוך האובידוקט. הזריקו באיטיות מיקרוליטר אחד של תמיסת ההזרקה וכחול טריפאן מסונן 5% לתוך האובידוקט, תוך התבוננות בתנועת התמיסה הכחולה והתרחבות הלומן של האובידוקט.
הימנעו מהחדרת בועות ללומן. לאחר ההזרקה, הסר את המחט מהאובידוקט וכסה את האזור הממוקד בפיסת נייר סופג שהושרה מראש ב- PBS. אחזו בנייר הספוג מראש ובאזור שיש לכוון אליו באמצעות זוג פינצטות אלקטרודות והתרחקו מהגוף.
אלקטרופורציה של אזור המטרה באמצעות שלושה פולסים חד-קוטביים במתח של 30 וולט למשך 50 אלפיות השנייה במרווחים של שנייה אחת. לאחר ההתחשמלות, הסר את נייר הספיגה והחזיר את העכבר לכרית החימום. שחררו את מהדק הבולדוג ודחפו בזהירות את מסלול הרבייה החשוף חזרה מתחת לדופן הגוף.
לאחר ששני האובידוקט התחשמלו והוחזרו מתחת לדופן הגוף, השתמשו במחזיק מחטים כדי לתפוס את המחט. צבטו והחזיקו צד אחד של אתר החיתוך באמצעות זוג מלקחיים סטריליים, מעוקלים ומשוננים. לאחר מכן, השתמש במחזיק המחט כדי לתפעל את התפר ולסגור את הפצע.
העבר את העכבר לכלוב נקי המונח על גבי כרית חימום ועקוב עד שהעכבר פעיל. לאחר אלקטרופורציה באמצעות אלקטרודות מסוג טוויטר של שלושה או מילימטר אחד, אזור המטרה שכותרתו TdTomato הוגבל לאפיתל האובידוקט הדיסטלי. עם אלקטרודות מסוג טוויטר של שלושה מילימטר, שטח גדול בהרבה של האמפולות היה מכוון בהשוואה למיקוד רק בקצה הדיסטלי ביותר, האינפונדיבולום, באמצעות אלקטרודות מסוג טוויטר של מילימטר אחד.
באזור היעד, תאים מחושמלים שסומנו על ידי TdTomato פוזרו באופן אקראי בין תאים שאינם מחושמלים. בנוסף, תאים מחושמלים הוגבלו לאפיתל הרירית ולא נצפו בשכבת הסטרומה או השריר הבסיסית. כדי לאשר עריכת גנום בתיווך קריספר, ניתן לבודד תאים פלואורסצנטיים על ידי מיון FACS לצורך בידוד וריצוף DNA.
זה מאפשר לנו לכמת את התדירות של אללים ממוקדים, לעקוב אחר התקשורת הייחודית בין הדגימות כדי לעקוב אחר האבולוציה העטרה in vivo של גידול ראשוני וגרורות בסביבה חיסונית.
