פיתחנו פרוטוקול מהיר ויעיל ליצירת אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן באמצעות עריכת גנים ex vivo של תאי אורותל רגילים של עכברים הנושאים אללים מטושטשים בגנים בעלי עניין. לשיטת ex vivo זו יש זרימת עבודה של שבוע עד שבועיים במקום שנים של גידול עכברים, והיא יעילה מאוד בהתמרת אדנו-וירוס במחיקת גנים בתיווך Cre. כדי להתחיל, הכינו את כל המכשירים והריאגנטים הסטריליים, כולל מספריים, מלקחיים, DPBS במנות תרבית של 35 מיליליטר, 70% אתנול, גזה ומגבות נייר נקיות.
לאחר מכן, נקו את כל המשטחים של אזור הנתיחה וכסו את אזור הנתיחה במגבת נייר נקייה. מניחים את העכבר המתת החסד על הגזה באזור הנתיחה ומרססים 70% אתנול על בטנו של העכבר, ולאחר מכן משתמשים במספריים כריתה סטריליים, מבצעים חתך בטן בקו האמצע התחתון כדי לחשוף את שלפוחית השתן. כעת, השתמשו במלקחיים כדי לתפוס ולמשוך בעדינות את שלפוחית השתן כדי לזהות את צומת השופכן הדו-צדדי.
באמצעות מספריים, מסירים את פונדוס שלפוחית השתן, עוקבים אחר קו הגבול בין שני פתחי השופכן ומעבירים את שלפוחית השתן לתוך צלחת סטרילית המכילה 2 מיליליטרים של DPBS, ואז מסירים את רקמת השומן והחיבור ומכניסים את שלפוחית השתן לתוך צלחת חדשה המכילה 2 מיליליטרים של DPBS. כמו כן, הסר את האדנו-וירוס מאחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס ושמור אותו על הקרח. לצורך דיסוציאציה של תאים, הכינו את כל המכשירים והריאגנטים הסטריליים כמתואר בכתב היד, ולאחר מכן בארון בטיחות ביולוגית, העבירו את שלפוחית השתן לצלחת של 35 מילימטר ושטפו עם 2 מיליליטרים של DPBS סטרילי.
אספו רקמות שלפוחית שתן מארבעה עכברים לתוך צלחת עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית שלם ללא FBS מופשט פחם. לאחר מכן, באמצעות להב כירורגי, לדחוס כל שלפוחית שתן לארבעה חלקים שווים, ולאחר מכן באמצעות מלקחיים, לפתוח את שלפוחית השתן כדי לחשוף את פני השטח של אורותליום למדיום. מעבירים את חלקי שלפוחית השתן ואת המדיום לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.
שטפו את התבשיל פעמיים עם 2 מיליליטרים של מדיום תרבית שלם ללא FBS מופשט פחם והוסיפו את הכביסה לצינור הצנטריפוגה, מה שמביא את הנפח הכולל ל-5 מיליליטרים. לאחר מכן, הוסיפו תערובת קולגן והיאלורונידאז והניחו את הצינור אופקית באינקובטור שייקר אורביטלי של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב-200 סל"ד. לאחר עיכול רקמות, הוסיפו נפח שווה של 10% FBS ו-DPBS מופשטים מפחם לתוך הצינור וצנטריפוגה ב-200 פעמים גרם למשך 5 דקות.
לאחר השלכת הסופרנאטנט, מוסיפים 2 מיליליטרים של תחליף טריפסין לכדור התא ומערבבים היטב, ואז מדגרים את הצינור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך 4 דקות. לאחר הדגירה, פיפט את התאים למעלה ולמטה 10 פעמים עם קצה P1000 סטנדרטי ולהוסיף 5 מיליליטרים של 10% FBS ו- DPBS מופשטים מפחם. מסננים את התאים המנותקים דרך מסננת תאים סטרילית של 100 מיקרומטר ואוספים את תרחיף התא בצינור של 50 מיליליטר.
מעבירים את מתלי התא לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-200 פעמים גרם למשך 5 דקות. לאחר הסרת הסופרנאטנט, החייאת הכדור ב 1 מיליליטר של מדיום תרבית שלם. ספרו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר וצלחת 0.5 פעמים 10 עד 6 לתוך כל באר של צלחת של 24 בארות עם 0.5 מיליליטר של מדיום תרבית שלמה ורענן.
לאחר מכן, הוציאו את תמציות המטריצה של תאי סרקומה של עכבר אנגלברת-הולם-נחיל מאחסון מינוס 20 מעלות צלזיוס והפשירו אותם על קרח. כמו כן, מחממים מראש צלחת של 6 בארות באינקובטור תאים של 37 מעלות צלזיוס. עבור התמרה אדנו-ויראלית, הוסיפו 2 מיקרוליטרים של אדנו-וירוס לתוך הצלחת בת 24 הבארות וערבבו היטב עם תאי האורותל המנותקים.
כדי לשפר את יעילות ההתמרה, בצע ספינוקולציה על ידי צנטריפוגה של הצלחת ב-300 פעמים גרם למשך 30 דקות, ולאחר מכן הדגירה של הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שעה אחת. מעבירים תאים ואמצעיים מהבאר לתוך צינור וצנטריפוגה של 15 מיליליטר ב-200 פעמים גרם למשך 5 דקות. לאחר השלכת ה-supernatant, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מדיום תרבית שלם וערבבו היטב עם התאים בתחתית.
לאחר מכן, הוסיפו 140 מיקרוליטרים של תמצית מטריצה וערבבו בעדינות היטב כדי להימנע מבועות אוויר, ואז צרו כיפות לאורגנואידים על ידי הוספה מהירה של 50 מיקרוליטרים של התמיסה לכל כיפה לתוך לוחית 6 הקידוחים שתוכננה מראש. דוגרים את הצלחת ומאפשרים לכיפות להתמצק במשך 5 דקות. לאחר 5 דקות, הפכו את צלחת 6 הבאר במהופך והמשיכו להתמצק במשך 25 דקות נוספות.
לאחר הדגירה, מוסיפים 2.5 מיליליטרים של מדיום תרבית שלם לכל באר ומניחים את הצלחת באינקובטור לתרבית אורגנואידית. החלבון הפלואורסצנטי הירוק זוהה בכמעט 100% מהתאים, מה שמרמז על יעילות גבוהה של התמרת אדנו-וירוס. צביעת המטוקסילין ואאוזין ואימונוהיסטוכימיה של גידולי אורגנואידים משולשים של נוקאאוט הראו את המורפולוגיה של קרצינומה אורותליאלית בדרגה גבוהה עם ביטוי חלבון חיובי של סמני תת-סוג בסיסיים של CK5 ו-p63.
האללים הלא-רקומבינים של פלוקס זוהו בתאי אורותל, שלא טופלו באמצעות אדנו-וירוס, בעוד שהאללים הרקומבינציה נצפו באורגנואידים המשולשים של הנוקאאוט. באופן כללי, 2 עד 3 שבועות היו נחוצים כדי ליצור גידול תת עורי 2 ס"מ. האימונוהיסטוכימיה של אורגנואידים בעלי נוקאאוט משולש, in vivo xenografts, הציגה ביטוי חיובי של חלבוני CK7, CK5 ו-p63.
ביטוי שלילי זוהה עבור חלבוני CK8 ואורופלקין. סמן המזנכים, וימנטין, זוהה רק בקפסולת הגידול או בסטרומה. הדיסוציאציה של שלפוחית השתן של העכבר לא תעלה על 30 דקות.
זמן דיסוציאציה ארוך יותר עשוי לגדול באחוז תאי הסטרומה, כגון תאי אנדותל ופיברובלסטים גישה זו יכולה להיות משולבת עם מיון תאים או סוג תא אדנווירוס מסוים כדי ליצור את סוג התא של אורגנואידים ספציפיים, כגון לומן לעומת אורגנואידים בסיסיים.
