מחקר זה נתמך על ידי המענקים הבאים (ל- D.A.T.): NIA RO1 AG074999, NIA R21AG051103, VA I21RX002223 ו- VA I21 BX003023.

כל הנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דיוק או הרשות המקומית המקבילה המסדירה מחקרים בבעלי חיים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, המכשירים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת מכשירים
<ol><li>ודאו שכל הפריטים וכלי הניתוח הדרושים נמצאים במקומם (איור 2): תמיסת ניקוי קרקפת (רפידות אלכוהול), סרט הדבקה, מלקחיים, מספריים ומקדחה להנחת חורי הבור הקטנים (0.5 מ"מ).</li>
	<li>הכינו את האלקטרודות החוץ-גולגולתיות ליישום הגולגולת, וודאו שכל דבק כירורגי נוקה מהן אם נעשה בהן שימוש בעבר.</li>
	<li>ודא את העכבה של אלקטרודות tACS אלה ישירות לפני החלתן על הגולגולת. לשם כך, השתמש בפונקציית המדידה המובנית של מגרה tACS עם שתי האלקטרודות הממוקמות באמבט מלוחים. הערה: העכבה המועדפת היא <5 KΩ לכל זוג אלקטרודות כדי לאפשר מעבר זרם מספיק על פני הגולגולת. מכשיר הממריץ בודק את העכבה לפני העברת פולסים בזרם קבוע ונותן את הערך ישירות.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65195/65195fig02.jpg"> איור 2: צילום של המכשור הנדרש, כולל כלי ניתוח ומספריים, להכנת הגירוי החוץ-גולגולתי. 1. מספריים לניתוח מיקרו, 11.5 ס"מ; 2. מלקחיים, 11.5 ס"מ, עקומה קלה, משונן; 3. Dumont #7 מלקחיים, מעוקל; 4. Dumont #5 מלקחיים; 5. מיקרו קורט, 13 ס"מ; 6. עצות Q; 7. סרט כירורגי; 8. רפידות אלכוהול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65195/65195fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. הכנת החיה לניתוח
הערה: עבור ניסויים אלה, השתמשנו ב-14 עכברי ביקורת C57BL/6 בגילאי 12 שבועות עד 33 שבועות, מתוכם חמישה זכרים ותשעה נקבות.
<ol><li>מרדימים את בעל החיים בתא אינדוקציה עם איזופלורן ב-30% O2 ב~1.5 ליטר/דקה, כאשר ~4% בתחילה לזירוז ו~1.25%-1.5% לשמור על רמת הרדמה עם נשימה ספונטנית ומספיק כדי לחסל את תגובת צביטת הזנב.</li>
	<li>העבירו את החיה למסגרת הסטריאוטקסית לאחר האינדוקציה, ואז הדביקו את הראש לתוך חרוט האף ומוטות האוזן עבור יישום האלקטרודות הבאות והליך חור הבור (איור 1 ואיור 3).</li>
	<li>חבר את חרוט האף של המסגרת הסטריאוטקסית לוופורייזר דרך כניסה ולשקע כדי להסיר כל שארית איזופלורן דרך מערכת נבלות (למשל, פחם או ואקום). ודאו שאין דליפות אוויר מחרוט האף, גם כדי לשמור על רמת ההרדמה עם האיזופלואורן וגם כדי למנוע דליפה מקרית לאוויר החדר (איור 3).</li>
	<li>בדקו את מיקום העכבר במסגרת הסטריאוטקסית, כולל מיקום חרוט האף, כדי לאפשר נשימה ספונטנית ללא אינטובציה, כמו גם התאוששות מתאימה מהרדמה ונבלות כדי להגן על אנשי המחקר (איור 3).</li>
	<li>מניחים את הבדיקות למדידת הדופק, ריווי החמצן בדופק (דופק OX), לחץ הדם והטמפרטורה על החיה; ודא שחמצון הדופק המינימלי הוא 90% והדופק הוא >450 לדקה (הגבול התחתון של האזעקה מוצג כ- 380 פעימות לדקה). תעד את הפרמטרים האלה במהלך ההליך במרווחי זמן קבועים או ברציפות, בהתאם למערכת ההקלטה (איור 3).</li>
	<li>לפני תחילת ההליך, בדוק את רמת ההרגעה של בעל החיים באמצעות (למשל) צביטת בוהן כדי לבדוק את הרפלקסים. אם אין רפלקס, אז רמת ההרגעה היא אופטימלית, כל עוד החיה שומרת על נשימה ספונטנית חמצון הדופק הולם. אם יש רפלקס, להגדיל את המסירה של isoflurane כדי להעמיק את רמת ההרדמה, ולאחר מכן לבדוק מחדש את הרפלקס. התבונן ועקוב ברציפות אחר תדירות הנשימה של החיה, והתאם את אספקת האיזופלורן בהתאם.</li>
	<li>לגלח את שיער הקרקפת או להסיר את השיער עם קרם depilatory (לנקות את שאריות קרם עם מעברים כרית אלכוהול).</li>
	<li>יש למרוח משחת עיניים, ולאחר מכן לנקות את הקרקפת עם שלושה מעברים של יוד ואלכוהול לפני הכריתה באמצעות מספריים.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65195/65195fig03.jpg"> איור 3: תמונה של החיה במסגרת הסטריאוטקטית, כשהגולגולת חשופה ורק אלקטרודות המגרה tACS נמצאות במקומן (לפני מיקום חור הבור). שימו לב למכשיר לחץ הדם סביב הזנב ומד הדופק אוקסימטר על הכפה, עם הקריאה בצד שמאל. ישנם צינורות נבלות עבור isoflurane סביב חרוט האף. קיצור: tACS = גירוי זרם חילופין תוך גולגולתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65195/65195fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
3. הליך כירורגי: הפעלת האלקטרודות המעוררות ויצירת חורי הבור
<ol><li>למחקר סופני, הסירו את הקרקפת באמצעות מספריים כירורגיים, וחשפו את הגולגולת ~3 מ"מ מתפר הלמבדואיד בצורה קאודלית ו~3 מ"מ קדמית לברגמה כדי לחשוף חלק מהתפר הקדמי האחורי. הבלו את הקרקפת באופן קודקודי כדי לחשוף את החלק הראשוני של השריר הרקתי משני הצדדים (איור 3).</li>
	<li>הסר את כל רקמות החיבור התת עוריות כך שהגולגולת נקייה ויבשה ליישום האלקטרודות המעוררות.</li>
	<li>יש למרוח ג'ל מוליך או להדביק על צד האלקטרודות שיהיו במגע עם הגולגולת, ולהדביק את האלקטרודות בדבק-על כירורגי סביב הקצה בנקודות לסירוגין. הערה: אין לאפשר לג'ל המוליך להפריע לדבק-העל הניתוחי על מנת לאפשר חיבור טוב יותר למשטח הגולגולת. ניתן גם לבודד את המשטח החיצוני של האלקטרודות (מהקרקפת אם הוא סגור במהלך ניתוח הישרדות) באמצעות דבק-על כירורגי.</li>
	<li>השתמש באלקטרודות שטוחות מסחריות, או צור אלקטרודות פנימיות באמצעות חוט מבודד בקוטר של 100 מיקרומטר (מולחם לצלחת) ולוח נחושת גמיש ומבודד (על משטח אחד) בגודל 1 מ"מ x 3 מ"מ החתוך בהתאם לגודל הגולגולת.</li>
	<li>מרחו משחת לידוקאין על השריר הרקתי והקרקפת משני הצדדים מבלי להפריע לאלקטרודות כדי להפחית את הפעלת השרירים והעצבים ההיקפיים.</li>
	<li>ברגע שהאלקטרודות החוץ-גולגולתיות מעוררות נמצאות במקומן 4 מ"מ לרוחב לכל צד של הגולגולת (בין הברגמה ללמדא), קדחו שני חורי בור בקוטר 0.5 מ"מ עבור אלקטרודות הזכוכית בקוטר 2 מ"מ בכל צד של קו האמצע, במרחק של 4 מ"מ זה מזה, אורתוגונליים לתפר הקשת (איור 1). מלאו את חורי הבור האלה בשמן מינרלי סטרילי כדי למנוע חדירת זרם לגולגולת מהאלקטרודות החוץ-גולגולתיות.</li>
	<li>אם רוצים שניסוי מסוים יגרום להתפשטות דיכאון (כלומר, דיכאון מתפשט המושרה על ידי אשלגן [K+-SD]), הוסיפו, בצד ימין של הגולגולת, חור בור שלישי בקוטר 0.5 מ"מ ~1.5 מ"מ רוסטרלי לתפר העטרה ו~1 מ"מ לטרלי לתפר הקדמי האחורי. מלא חור בור זה במי מלח ליישום מאוחר יותר של 1 M KCl כדי לגרום ל- K+-SD.</li>
	<li>בדוק את העכבה של האלקטרודות הממריצות מחוץ לגולגולת הן לפני מיקום חור הבור (ובהשוואה לאותן אלקטרודות שהונחו באמבט מלח) והן לאחר מיקום חור הבור כדי לוודא שחורי הבור אינם מפריעים לזרימת הזרם למוח (כלומר, לוודא שההתנגדות אינה משתנה). הערה: מדידת העכבה מסופקת ישירות על-ידי ההתקן המגרה. באופן כללי, מצאנו שעכבת המערכת הכוללת (כלומר, מהאלקטרודות החוץ-גולגולתיות לאורך מסלול הגולגולת/המוח, בדרך כלל ~3 KΩ) קבועה יחסית ללא קשר לחורי הבור ולמיקרואלקטרודות הזכוכית, מה שמצביע על כך שיש דליפת זרם מינימלית ישירות למוח דרך חורי הבור.</li>
	<li>מקם את אלקטרודות הגירוי הטרנס-גולגולתי הכרוני לגירוי כרוני באופן דומה. במקרה זה, בודדו את פני השטח החיצוניים של האלקטרודות, סגרו את הקרקפת, והעבירו את החוטים המבודדים החוצה דרך הקרקפת או ניתבו אותם לשלב ראש קבוע המורכב על הגולגולת.</li>
</ol>4. הליך פיזיולוגי
<ol><li>נתחיל בהיבטים הפיזיולוגיים של הניסוי, ברגע שבעל החיים מוכן לחלוטין לניסוי הפיזיולוגי שאינו הישרדותי. יש לשמור על רמת הרדמה המספיקה הן לנשימה ספונטנית והן לדופק תקין.</li>
	<li>למדוד את CBF הנובע גירוי מחוץ לגולגולת על ידי אחת משתי השיטות הבאות.<ol><li>הניחו את העכבר מתחת למכשיר הדמיה של כתמי לייזר עם או בלי אלקטרודות רישום תוך גולגולתיות כדי למדוד את השדה החשמלי התוך גולגולתי במהלך אירועי גירוי (איור 3).</li>
		<li>העבירו את החיה להכנה פיזיולוגית למיקום בדיקות דופלר לייזר דו-צדדיות ואלקטרודות תוך גולגולתיות כדי למדוד את השדה החשמלי התוך-גולגולתי במהלך אפיזודות גירוי (איור 1).</li>
	</ol></li>
</ol>5. מיקום דופלר לייזר דו-צדדי ואלקטרודות זכוכית
<ol><li>העבר את החיה לשלב מיקרוסקופ ליישום בדיקות דופלר לייזר דו-צדדיות. הניחו את הגשושיות על החלק העליון של משטח הגולגולת בין חורי הבור הדו-צדדיים לתפר העטרה (איור 1).</li>
	<li>מלאו מיקרואלקטרודות זכוכית משוכות (~0.1 μM, עכבה של 2-6 MΩ) ב-0.2 M NaCl, והניחו אותן באמצעות מיקרומניפולטור לתוך שני חורי הבור הממוקמים לרוחב לתפר הקשת 3,14 (איור 1). הערה: חורי הבור האלה נמצאים בין שתי אלקטרודות הגירוי החוץ-גולגולתי הסימטרי (איור 1).</li>
	<li>לאחר החדרתן למוח, ודאו שמיקרואלקטרודות הזכוכית האלה נמצאות ~1 מ"מ בתוך קליפת המוח. ביצוע פרופילי עומק בעומקים סימטריים שונים. מלאו מחדש את חורי הבור בשמן מינרלי סטרילי כדי לבודד מסלול זה לזרימת זרם.</li>
</ol>6. הליך גירוי ומדידת עוצמת גירוי זרם חילופין תוך גולגולתי (tACS) או גירוי זרם ישיר תוך גולגולתי (tDCS)
<ol><li>הקלט נתונים רציפים מבדיקות דופלר לייזר כפולות על הגולגולת ושתי יציאות מיקרואלקטרודות תוך גולגולתיות (שהוקלטו באמצעות מגבר DC עם במות-ראש) באמצעות מערכת דיגיטציה ותוכנה עם לפחות ארבעה ערוצים (בקצב דגימה של 1 קילוהרץ). לאחר שכל הערכים נרשמו במשך בסיס יציב מספיק (כלומר, >10 דקות), בדוק את הגירוי החוץ-גולגולתי. הערה: איור 4 מראה דוגמה של ארבע התעלות עם שתי אלקטרודות רישום תוך גולגולתיות בתעלות העליונות ותגובת CBF בתעלות התחתונות.</li>
	<li>הפעילו פרקי זמן קצרים של גירוי הפעלה/כיבוי באמפליטודות שונות (כלומר, 20-30 שניות, 0.5-2.0 מיליאמפר, בטווח הנסבל) כדי לקבל קו בסיס ברור לפני ואחרי הגירוי (איור 4). הפעילו את הגירוי בין שתי אלקטרודות tACS של הגולגולת משני הצדדים (איור 1) באמצעות מכשיר גירוי מסחרי תואם לבני אדם שמספק זרם קבוע.</li>
	<li>התבונן מקרוב בעכבר עבור עוויתות שרירים או תגובות אחרות ל- tACS, כגון שינוי בדופק או בנשימה, כדי ליצור גבול עליון של סבילות (בדרך כלל ~ 2 mA).</li>
	<li>המשך לעקוב אחר העכבה על פני האלקטרודות עם תקופות גירוי כדי להבטיח שזה קבוע.</li>
	<li>הוסף כמות קטנה (2-3 μL) של 1 M KCl לחור הבור הקדמי14 כדי לגרום לאירועי K+-SD ספונטניים. אלה יוצרים תגובת CBF גדולה ואינטראקציות בין תגובת CBF המושרה על ידי K+-SD לבין תגובת CBF. הערך את תגובת tACS CBF, תוך יישום גירוי tACS לפני ואחרי התרחשות ה- SD.</li>
	<li>בסוף הניסוי, בצע המתת חסד באמצעות מנת יתר של איזופלורן (5%) ולאחר מכן ערוף את ראשו לאחר הפסקת הנשימה ופעימות הלב.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65195/65195fig04.jpg"> איור 4: נתונים המציגים ארבעה ערוצים של נתונים גולמיים בתגובה ל-tACS בעוצמה נמוכה. הנתונים מסודרים עם שתי השורות העליונות כהקלטות חשמליות DC ישירות תוך גולגולתיות (מסומנות כקלט 1 [IN0] וקלט 2 [IN1]) ושתי השורות התחתונות כרישומי דופלר לייזר דו-צדדיים של זרימת הדם במוח. שימו לב שהתגובות אינן סימטריות בין עקבות זרימת הדם החשמליות והמוחיות הימניות (העליונות) והשמאליות (התחתונות). (A) תגובה קטנה (עלייה של 16% בזרימת הדם) בתגובה לגירוי של 1.2 mV/mm 20 s (0.75 mA). (B) תגובה גדולה יותר (עלייה של 21% בזרימת הדם) בתגובה לגירוי של 1.4 mV/mm (1.0 mA). קיצור: tACS = גירוי זרם חילופין תוך גולגולתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65195/65195fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
7. חישוב השדה החשמלי
<ol><li>מדדו את ההבדל בפלט משתי האלקטרודות התוך-גולגולתיות באמצעות ההבדל בחצי הגל (מחזור אחד) של שני גלי הסינוס שתועדו (שני העקבות העליונים באיור 4). חלק הפרש זה (mV) במרחק בין שתי האלקטרודות (מ"מ, כאן ~ 4 מ"מ אך נמדד ישירות בכל מקרה) כדי להגיע לעוצמת השדה (mV/mm)3,6.</li>
</ol>

מיפוי זרימת דם מוחית ושדות חשמליים: מיקום אלקטרודות בעכברים

<ol>
	<li>Bestmann, S., Walsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+electrical+stimulation.">Transcranial electrical stimulation.</a> Current Biology. 27 (23), R1258-R1262 (2017).</li><li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rigor+and+reproducibility+in+research+with+transcranial+electrical+stimulation:+An+NIMH-sponsored+workshop.">Rigor and reproducibility in research with transcranial electrical stimulation: An NIMH-sponsored workshop.</a> Brain Stimulation. 11 (3), 465-480 (2018).</li><li>Turner, D. A., Degan, S., Galeffi, F., Schmidt, S., Peterchev, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+dose-dependent+enhancement+of+cerebral+blood+flow+by+transcranial+AC+stimulation+in+mouse.">Rapid, dose-dependent enhancement of cerebral blood flow by transcranial AC stimulation in mouse.</a> Brain Stimulation. 14 (1), 80-87 (2020).</li><li>Shah, S., Chhatbar, P. Y., Feld, J. A., Feng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+tDCS+into+routine+inpatient+rehabilitation+practice+to+boost+post-stroke+recovery.">Integrating tDCS into routine inpatient rehabilitation practice to boost post-stroke recovery.</a> Brain Stimulation. 13 (4), 953-954 (2020).</li><li>Voroslakos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+effects+of+transcranial+electric+stimulation+on+brain+circuits+in+rats+and+humans.">Direct effects of transcranial electric stimulation on brain circuits in rats and humans.</a> Nature Communications. 9 (1), 483 (2018).</li><li>Alekseichuk, I., Mantell, K., Shirinpour, S., Opitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+modeling+of+transcranial+magnetic+and+electric+stimulation+in+mouse,+monkey,+and+human.">Comparative modeling of transcranial magnetic and electric stimulation in mouse, monkey, and human.</a> Neuroimage. 194, 136-148 (2019).</li><li>Tavakoli, A. V., Yun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+alternating+current+stimulation+(tACS)+mechanisms+and+protocols.">Transcranial alternating current stimulation (tACS) mechanisms and protocols.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 214 (2017).</li><li>Yavari, F., Jamil, A., Mosayebi Samani, M., Vidor, L. P., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+and+functional+effects+of+transcranial+electrical+stimulation+(tES)-An+introduction.">Basic and functional effects of transcranial electrical stimulation (tES)-An introduction.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 85, 81-92 (2018).</li><li>Wachter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcranial+direct+current+stimulation+induces+polarity-specific+changes+of+cortical+blood+perfusion+in+the+rat.">Transcranial direct current stimulation induces polarity-specific changes of cortical blood perfusion in the rat.</a> Experimental Neurology. 227 (2), 322-327 (2011).</li><li>Han, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+responses+in+rat+brain+during+transcranial+direct+current+stimulation:+A+functional+near-infrared+spectroscopy+study.">Hemodynamic responses in rat brain during transcranial direct current stimulation: A functional near-infrared spectroscopy study.</a> Biomedical Optics Express. 5 (6), 1812-1821 (2014).</li><li>Ayata, C., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+depression,+spreading+depolarizations,+and+the+cerebral+vasculature.">Spreading depression, spreading depolarizations, and the cerebral vasculature.</a> Physiological Reviews. 95 (3), 953-993 (2015).</li><li>Berenyi, A., Belluscio, M., Mao, D., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed-loop+control+of+epilepsy+by+transcranial+electrical+stimulation.">Closed-loop control of epilepsy by transcranial electrical stimulation.</a> Science. 337 (6095), 735-737 (2012).</li><li>Hoang, K. B., Cassar, I. R., Grill, W. M., Turner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+and+stimulation+algorithms+for+adaptive+brain+stimulation.">Biomarkers and stimulation algorithms for adaptive brain stimulation.</a> Frontiers in Neuroscience. 11, 564 (2017).</li><li>Turner, D., A, D. S., Hoffmann, U., Galleffi, F., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CVN-AD+Alzheimer's+mice+show+premature+reduction+in+neurovascular+coupling+in+response+to+spreading+depression+and+anoxia+compared+to+aged+controls.">CVN-AD Alzheimer's mice show premature reduction in neurovascular coupling in response to spreading depression and anoxia compared to aged controls.</a> Alzheimer's and Dementia. 17 (7), 1109-1120 (2021).</li><li>Colton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mNos2+deletion+and+human+NOS2+replacement+in+Alzheimer+disease+models.">mNos2 deletion and human NOS2 replacement in Alzheimer disease models.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 73 (8), 752-769 (2014).</li><li>Castano-Prat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+slow+(&lt;1+Hz)+and+fast+(beta+and+gamma)+neocortical+oscillations+in+the+3xTg-AD+mouse+model+of+Alzheimer's+disease+under+anesthesia.">Altered slow (&lt;1 Hz) and fast (beta and gamma) neocortical oscillations in the 3xTg-AD mouse model of Alzheimer's disease under anesthesia.</a> Neurobiology of Aging. 79, 142-151 (2019).</li><li>Etter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+gamma+stimulation+rescues+memory+impairments+in+an+Alzheimer's+disease+mouse+model.">Optogenetic gamma stimulation rescues memory impairments in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Nature Communications. 10 (1), 5322 (2019).</li><li>Iaccarino, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+frequency+entrainment+attenuates+amyloid+load+and+modifies+microglia.">Gamma frequency entrainment attenuates amyloid load and modifies microglia.</a> Nature. 540 (7632), 230-235 (2016).</li><li>Martorell, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-sensory+gamma+stimulation+ameliorates+Alzheimer's-associated+pathology+and+improves+cognition.">Multi-sensory gamma stimulation ameliorates Alzheimer's-associated pathology and improves cognition.</a> Cell. 177 (2), 256-271 (2019).</li><li>Dawson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagus+nerve+stimulation+paired+with+rehabilitation+for+upper+limb+motor+function+after+ischaemic+stroke+(VNS-REHAB):+A+randomised,+blinded,+pivotal,+device+trial.">Vagus nerve stimulation paired with rehabilitation for upper limb motor function after ischaemic stroke (VNS-REHAB): A randomised, blinded, pivotal, device trial.</a> Lancet. 397 (10284), 1545-1553 (2021).</li><li>Hacker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+brain+stimulation+in+early-stage+Parkinson+disease:+Five-year+outcomes.">Deep brain stimulation in early-stage Parkinson disease: Five-year outcomes.</a> Neurology. 95 (4), e393-e401 (2020).</li><li>Duun-Henriksen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+era+in+electroencephalographic+monitoring?+Subscalp+devices+for+ultra-long-term+recordings.">A new era in electroencephalographic monitoring? Subscalp devices for ultra-long-term recordings.</a> Epilepsia. 61 (9), 1805-1817 (2020).</li><li>Haneef, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-scalp+electroencephalography:+A+next-generation+technique+to+study+human+neurophysiology.">Sub-scalp electroencephalography: A next-generation technique to study human neurophysiology.</a> Clinical Neurophysiology. 141, 77-87 (2022).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

פרוטוקול זה מתמקד במדידה in vivo, מורדמת, של תגובת CBF כסמן ביולוגי להערכת תגובת המוח ל-tES14. סמנים ביולוגיים ארוכי טווח של תגובת tES כוללים השפעות טיפול היסטולוגיות, כגון מניעה או שינויים בהיווצרות רובד העמילואיד (כלומר, עם גירוי גמא ב -40 הרץ במספר מודלים של אלצהיימר)16,17...

גירוי חשמלי תוך גולגולתי (tES; עם גירוי גל סינוס, tACS) היא גישה נפוצה, חיצונית ולא פולשנית לנוירומודולציהמוחית 1,2. בעבר, שיערנו כי במינונים מסוימים, tES (ובמיוחד tACS) עשוי להגביר את זרימת הדם במוח (CBF) באזורי המוח הבסיסיים3. יתר על כן, קשר מנה-תגובה עשוי להתקיים בין הזרם החיצוני המופעל או השדה החשמלי תוך גולגולתי לבין תגובות CBF הנובעות מכך. עם זאת, רוב פרוטוקולי הגירוי הקליניים התמקדו ברמת גירוי מקסימלית נוחה של העור (כלומר, ~ 2 mA) לפרקי זמן מתוכננים (כלומר, 30-45 דקות) כפרוטוקול טיפול 4,5. במכרסמים ניתן להשתמש באלקטרודות מוח חוץ-גולגולתיות פולשניות המופעלות ישירות על הגולגולת כדי לחקור את השדות החשמליים במוח המושרים על ידי tES6. לפיכך, מטרת גישה זו היא לקבוע את ההשפעות של עוצמת tACS בתדרים הרלוונטיים על שינויי CBF במונחים של יחסי מנה-תגובה. עקומת מינון-תגובה זו מבוססת על סמן ביולוגי פיזיולוגי קצר טווח - מדידות ישירות של CBF - ביחס לשדה החשמלי המוטל על המוח3. הראינו בעבר כי באמפליטודות גדולות יותר, בדרך כלל מעבר לטווח השדות החשמליים במוח המושרים על ידי tACS מבחינה קלינית, קיים מתאם כמעט ליניארי בין השדה החשמלי המושרה לבין CBF בקליפת המוח3. עם זאת, גירוי בשדה קטן יותר (כלומר, עוצמה של 1-5 mV/mm) עשוי להיות רלוונטי יותר ואפשרי יותר לשימוש בבני אדם; לפיכך, שינינו את הטכניקות שלנו כדי לזהות שינויים קטנים יותר ב- CBF.
מאמר זה מתאר פרוטוקול לניתוח ההשפעות של זרמי סינוס לסירוגין tES בחוזק שדה נמוך יותר (tACS) על CBF (כלומר, זרם 0.5-2.0 mA, שדה חשמלי 1-5 mV/mm), אשר יכול להיות נסבל על ידי מכרסמים ערים5. פרוטוקול זה כולל שימוש בדימות לייזר חדשני במהלך tACS, כמו גם אלקטרודות זכוכית תוך גולגולתית כפולות, כדי לקבוע הן את התפשטות tACS הפעיל בתוך המוח (כפי שמנוטר על-ידי CBF) והן את עוצמת השדה החשמלי התוך-גולגולתי, שמוצג גם כתרשים וגם כתצלום ניסויי ממשי (איור 1). ישנן השפעות פיזיולוגיות אפשריות רבות של tES במוח, כולל אפנון עצבי ישיר, פלסטיות עצבית והפעלת אסטרוציטים 7,8. למרות ש- CBF נמדד עם tDCS 9,10, מדידות אלה היו איטיות, עקיפות ולא מספיקות להערכת תפקוד המינון-תגובה במוח. לכן, על ידי שימוש בסמנים ביולוגיים מתאימים לטווח קצר (כלומר, CBF, שדות חשמליים) ורצפי הפעלה/כיבוי מהירים של tACS, אנו יכולים כעת להעריך את פונקציית תגובת המינון בצורה מדויקת יותר. יתר על כן, אנו יכולים ליישם טכניקות שונות למדידת CBF, כולל בדיקות דופלר לייזר מוקדיות (LD) והדמיית כתמי לייזר (LSI) עם אזורי עניין מוגדרים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65195/65195fig01.jpg"> איור 1: דיאגרמת גירוי תוך גולגולתי ודוגמה צילומית . (A) דיאגרמה של מערך הגירוי הטרנס-גולגולתי. התרשים מציג גולגולת עכבר עם תפרים קורונליים וסגיטליים. האלקטרודות הטרנס-גולגולתיות ממוקמות לרוחב וסימטריה על הגולגולת ומותקנות בדבק כירורגי ובהדבקה מוליכה בין האלקטרודות לגולגולת. אלקטרודות אלה מחוברות למכשיר גירוי זרם קבוע התואם לבני אדם, שיכול לציין את התדירות, המשרעת ומשך הגירוי. לצורך הערכת שדות חשמליים תוך גולגולתיים, אלקטרודות זכוכית דו-צדדיות (~2 MΩ) ממוקמות בקליפת המוח (כלומר, בטווח של 1 מ"מ מהאספקט הפנימי של הגולגולת דרך חורי בור קטנים), ואלה אטומות בשמן מינרלי ויש להן קרקע AgCl בשריר הצוואר (מוצגים כחוטים גדולים יותר במרכז הקבורים ברקמת הצוואר התת עורית). אלקטרודות זכוכית אלה מחוברות למגבר DC, והיציאות שלהן נרשמות באמצעות דיגיטציה בעלת ארבעה ערוצים לפחות. בדיקות דופלר לייזר דו-צדדיות ממוקמות גם על הגולגולת לצורך הקלטות. הגולגולת כולה מצולמת גם באמצעות מכשיר הדמיה של כתמי לייזר או מצלמה מקוררת ברזולוציה גבוהה (לפחות 1,024 x 1,024 פיקסלים, עומק פיקסלים של 12-14 סיביות) לזיהוי אותות אופטיים פנימיים. התדר האיזוסבסטי של המוגלובין נבחר בדרך כלל (כלומר, 562 ננומטר) להארה לצורך הדמיית זרימת דם. (B) תמונת תקריב של ניסוי אמיתי, המראה את גשושיות דופלר הלייזר הדו-צדדיות (משמאל), את מיקרואלקטרודות רישום הזכוכית התוך-גולגולתית (הדו-צדדית) הממוקמות דרך חורי הבור, ועם אלקטרודות מעוררות tACS לרוחב. קיצור: tACS = גירוי זרם חילופין תוך גולגולתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65195/65195fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
כדרך להעריך את המנגנונים, אנו יכולים גם לחקור אינטראקציות עם תהליכים פיזיולוגיים אחרים שגם משנים את CBF, כגון K+ המושרה התפשטות depolarization11. יתר על כן, במקום פגישות מתוכננות בזמנים קבועים, ניתן גם לפתח מערכת לולאה סגורה המבוססת על סמנים ביולוגיים נוספים למגוון מחלות, כפי שהוצע לטיפול באפילפסיה12 (כלומר, מכשירי נוירופייס קליניים). לדוגמה, גירוי מוחי בלולאה סגורה עבור מחלת פרקינסון מבוסס בדרך כלל על פוטנציאלי שדה מקומיים פנימיים חריגים (LFPs) המהותיים למחלה זו בהיעדר מספיק דופמין (בדרך כלל LFPs β-band)13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alcohol pads</td>
			<td>HenryShein</td>
			<td>112-6131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby mineral oil</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL syringe</td>
			<td>Becton Dikinson</td>
			<td>REF 305699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C3 Flat Surface Electrodes</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BI mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from NIH colonies&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper skull electrods</td>
			<td>In house preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1440, Clampex</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>#5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 forceps curved</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Major</td>
			<td>LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td>Sutter instrument Co.</td>
			<td>Model P-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps 11.5 cm slight curve&#160; serrated</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-8254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intramedic needle 23 G</td>
			<td>Becton Dikinson</td>
			<td>REF 427565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl 1 M</td>
			<td>In house preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler Probes</td>
			<td>Moor Instruments</td>
			<td>0.46 mm laser doppler probes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Speckle Imaging Device</td>
			<td>RWD</td>
			<td>RFLSI-ZW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro curette 13 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>10080-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors, 11.5 cm</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anesthesia fixation</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuroconn-DS</td>
			<td>Neurocare</td>
			<td>DC-Stimulator Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhysioSuite Monitoring</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline 0.9% NaCl solution</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>281322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sensicam QE</td>
			<td>PCO Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Axon Instruments Clampex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>31477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>3M Transpore</td>
			<td>T9784</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

placement of extracranial stimulating electrodes and measurement of cerebral blood flow and intracranial electrical fields in anesthetized mice

זיהוי תגובות זרימת דם מוחיות (CBF) לצורות שונות של הפעלה עצבית הוא קריטי להבנת תפקוד המוח הדינמי ושינויים באספקת המצע למוח. מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידת תגובות CBF לגירוי זרם חילופין תוך גולגולתי (tACS). עקומות מנה-תגובה מוערכות הן משינוי CBF המתרחש עם tACS (mA) והן מהשדה החשמלי התוך גולגולתי (mV/mm). אנו מעריכים את השדה החשמלי התוך-גולגולתי בהתבסס על המשרעות השונות שנמדדו על-ידי מיקרואלקטרודות זכוכית בכל צד של המוח. במאמר זה, אנו מתארים את מערך הניסוי, הכולל שימוש בבדיקות דופלר לייזר דו-צדדיות (LD) או בדימות כתמי לייזר (LSI) כדי למדוד את CBF; כתוצאה מכך, מערך זה דורש הרדמה לצורך מיקום האלקטרודה ויציבותה. אנו מציגים מתאם בין תגובת CBF לבין הזרם כפונקציה של גיל, ומראים תגובה גדולה משמעותית בזרמים גבוהים יותר (1.5 mA ו- 2.0 mA) בחיות ביקורת צעירות (12-14 שבועות) בהשוואה לחיות מבוגרות יותר (28-32 שבועות) (p < 0.005 הפרש). אנו גם מדגימים תגובת CBF משמעותית בעוצמות שדה חשמלי <5 mV/mm, המהווה שיקול חשוב במחקרים בבני אדם בסופו של דבר. תגובות CBF אלה מושפעות מאוד גם משימוש בהרדמה בהשוואה לבעלי חיים ערים, מבקרת הנשימה (כלומר, נשימה אינטובטית לעומת נשימה ספונטנית), גורמים סיסטמיים (כלומר,CO2) והולכה מקומית בתוך כלי הדם, המתווכת על ידי פריציטים ותאי אנדותל. באופן דומה, טכניקות הדמיה/הקלטה מפורטות יותר עשויות להגביל את גודל השדה מהמוח כולו לאזור קטן בלבד. אנו מתארים את השימוש באלקטרודות חוץ-גולגולתיות ליישום גירוי tACS, כולל עיצובי אלקטרודות ביתיות ומסחריות עבור מכרסמים, המדידה המקבילה של CBF והשדה החשמלי התוך גולגולתי באמצעות אלקטרודות הקלטה DC מזכוכית דו-צדדית, וגישות ההדמיה. אנו מיישמים כיום טכניקות אלה כדי ליישם פורמט לולאה סגורה להגדלת CBF במודלים של בעלי חיים של מחלת אלצהיימר ושבץ.

Transcranial electrical stimulation (tES; with sine wave stimulation, tACS) is a common, external, non-invasive approach to brain neuromodulation1,2. Previously, we hypothesized that at certain doses, tES (and particularly tACS) may increase the cerebral blood flow (CBF) in the underlying brain regions3. Further, a dose-response relationship may exist between either the external current applied or the intracranial electrical field and the resulting CBF responses. However, most clinical stimulation protocols have focused on a maximal comfortable skin level of stimulation (i.e., ~ 2 mA) for scheduled periods of time (i.e., 30-45 min) as a treatment protocol4,5. In rodents, it is possible to use invasive, extracranial brain electrodes applied directly to the skull to investigate the electrical fields in the brain induced by tES6. Hence, the goal of this approach is to determine the effects of the intensity of tACS at relevant frequencies on CBF changes in terms of the dose-response relationship. This dose-response curve is based on a short-term physiological biomarker-direct measurements of the CBF-in relation to the electrical field imposed on the brain3. We have previously shown that, at larger amplitudes, typically beyond the range of electrical fields within the brain induced by tACS clinically, there is a near-linear correlation between the induced electrical field and the CBF in the cortex3. However, smaller-field stimulation (i.e., 1-5 mV/mm intensity) may be more relevant and feasible for use in humans; hence, we have modified our techniques to detect smaller CBF changes.
This paper describes a protocol to analyze the effects of lower-field strength tES alternating sine currents (tACS) on CBF (i.e., 0.5-2.0 mA current, 1-5 mV/mm electrical field), which can be tolerated by awake rodents5. This protocol involves the use of novel laser speckle imaging during tACS, as well as dual intracranial glass electrodes, to determine both the spread of active tACS within the brain (as monitored by the CBF) and the intracranial electrical field intensity, which is shown both as a diagram and an actual experimental photograph (Figure 1). There are many possible physiological effects of tES within the brain, including direct neuronal modulation, neural plasticity, and astrocyte activation7,8. Though CBF has been measured with tDCS9,10, these measurements were slow, indirect, and insufficient for assessing the dose-response function in the brain. Therefore, by using appropriate short-term biomarkers (i.e., CBF, electrical fields) and rapid on/off sequences of tACS, we can now estimate the dose-response function more accurately. Further, we can apply different techniques to measure the CBF, including both focal laser Doppler probes (LD) and laser speckle imaging (LSI) with defined regions of interest.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65195/65195fig01.jpg" /> 
Figure 1: Transcranial stimulation diagram and photographic example. (A) Diagram of the transcranial stimulation setup. The diagram shows a mouse skull with coronal and sagittal sutures. The transcranial electrodes are placed laterally and symmetrically on the skull and are mounted with surgical glue and conductive paste between the electrodes and the skull. These electrodes are connected to a human-compatible, constant-current stimulation device, which can specify the frequency, amplitude, and duration of stimulation. For the assessment of intracranial electrical fields, bilateral glass electrodes (~2 M&#8486;) are placed in the cerebral cortex (i.e., within 1 mm of the inner aspect of the skull through small burr holes), and these are sealed with mineral oil and have AgCl grounds in the neck muscle (shown as larger wires in the center buried into the subcutaneous neck tissue). These glass electrodes are connected to a DC amplifier, and their outputs are recorded through a digitizer with at least four channels. Bilateral laser Doppler probes are also placed on the skull for recordings. The entire skull is also imaged with either a laser speckle imaging device or a high-resolution (at least 1,024 x 1,024 pixels, 12-14 bit pixel depth) cooled camera for intrinsic optical signal detection. The hemoglobin isosbestic frequency is typically chosen (i.e., 562 nm) for illumination for blood flow imaging. (B) A close-up image of an actual experiment, showing the bilateral laser Doppler probes (to the left), the (bilateral) intracranial glass recording microelectrodes placed through the burr holes, and with the tACS stimulating electrodes laterally. Abbreviation: tACS = transcranial alternating current stimulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65195/65195fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
As a way of assessing the mechanisms, we can also interrogate interactions with other physiological processes that also alter the CBF, such as K+-induced spreading depolarization11. Further, rather than scheduled sessions at regular times, it is also possible to develop a closed-loop system based on additional biomarkers for a variety of diseases, as has been proposed for epilepsy treatment12 (i.e., clinical Neuropace devices). For example, closed-loop brain stimulation for Parkinson&#39;s disease is commonly based on the intrinsic, abnormal local field potentials (LFPs) intrinsic to this disease in the absence of sufficient dopamine (typically &#946;-band LFPs)13.

מחבר זרקור: גישה מבוססת גירוי לשיפור זרימת הדם במוח במודל של אלצהיימר 

מיקום אלקטרודות מעוררות חוץ-גולגולתיות ומדידת זרימת דם מוחית ושדות חשמליים תוך גולגולתיים בעכברים מורדמים

The cerebral blood flow can be measured by the degree of saturation of oxy deoxy hemoglobin. This increase in saturation is reduced with aging and in Alzheimer's model. We're estimating the strength of electrical stimulation using both applied currents and the intracranial electrical field density.The most recent developments include improving extracranial stimulation for application to animal models of Alzheimer's disease. Currently, multiple imaging technologies in animal models, including laser spectral imaging, dual photo microscopy, and the physiological recording are used. The challenge is understanding the mechanistic basis for changes in dynamic cerebral blood flow responses in models of Alzheimer's disease.We found the deficits in responses to metabolic challenges in Alzheimer's models mice, and applying extra cranial stimulation improves these deficits. The advantage of our protocol is that a stimulation-based approach improves cerebral blood flow.

תוצאות מייצגות מוצגות באיור 4, איור 5 ואיור 6. איור 4 מראה דוגמה של ארבע התעלות עם שתי אלקטרודות ההקלטה התוך-גולגולתית בתעלות העליונות ותגובות CBF בתעלות התחתונות. ה-tACS סימטרי לאורך הגולגולת, אולם באופן כללי, תגובת השדה התוך-גול?...

Watch this Scientific Journal Video about Stimulation-Based Approach to Improve Cerebral Blood Flow in Alzheimer's Model at JoVE.com

אנו מתארים פרוטוקול להערכת עקומות מנה-תגובה לגירוי חוץ-גולגולתי במונחים של מדידות שדה חשמלי במוח וזרימת דם רלוונטית של סמן ביולוגי-מוחי. מכיוון שפרוטוקול זה כולל החדרת אלקטרודות פולשניות למוח, יש צורך בהרדמה כללית, כאשר נשימה ספונטנית עדיפה על פני נשימה מבוקרת.

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and ...

זרימת הדם המוחית יכולה להימדד על ידי מידת הרוויה של המוגלובין oxy deoxy. עלייה זו ברוויה מופחתת עם ההזדקנות ובמודל האלצהיימר. אנו מעריכים את עוצמת הגירוי החשמלי באמצעות זרמים מופעלים וצפיפות השדה החשמלי תוך גולגולתי.ההתפתחויות האחרונות כוללות שיפור גירוי חוץ-גולגולתי ליישום מודלים של מחלת אלצהיימר בבעלי חיים. כיום, נעשה שימוש בטכנולוגיות הדמיה מרובות במודלים של בעלי חיים, כולל הדמיה ספקטרלית בלייזר, מיקרוסקופ צילום כפול ורישום פיזיולוגי. האתגר הוא הבנת הבסיס המכניסטי לשינויים בתגובות דינמיות של זרימת דם מוחית במודלים של מחלת אלצהיימר.מצאנו את הליקויים בתגובות לאתגרים מטבוליים בעכברי מודלים של אלצהיימר, והפעלת גירוי גולגולתי נוסף משפרת את הליקויים הללו. היתרון של הפרוטוקול שלנו הוא שגישה מבוססת גירוי משפרת את זרימת הדם במוח.

placement-extracranial-stimulating-electrodes-measurement-cerebral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Placement of Extracranial Stimulating Electrodes and Measurement of Cerebral Blood Flow and Intracranial Electrical Fields in Anesthetized Mice

828 Views.  Duke University Medical Center. זרימת הדם המוחית יכולה להימדד על ידי מידת הרוויה של המוגלובין oxy deoxy. עלייה זו ברוויה מופחתת עם ההזדקנות ובמודל האלצהיימר. אנו מעריכים את עוצמת הגירוי החשמלי באמצעות זרמים מופעלים וצפיפות השדה החשמלי תוך גולגולתי.ההתפתחויות האחרונות כוללות שיפור גירוי חוץ-גולגולתי ליי...

Video: מחבר זרקור: גישה מבוססת גירוי לשיפור זרימת הדם במוח במודל של אלצהיימר 

The detection of cerebral blood flow (CBF) responses to various forms of neuronal activation is critical for understanding dynamic brain function and variations in the substrate supply to the brain. This paper describes a protocol for measuring CBF responses to transcranial alternating current stimulation (tACS). Dose-response curves are estimated both from the CBF change occurring with tACS (mA) and from the intracranial electric field (mV/mm). We estimate the intracranial electrical field based on the different amplitudes measured by glass microelectrodes within each side of the brain. In this paper, we describe the experimental setup, which involves using either bilateral laser Doppler (LD) probes or laser speckle imaging (LSI) to measure the CBF; as a result, this setup requires anesthesia for the electrode placement and stability. We present a correlation between the CBF response and the current as a function of age, showing a significantly larger response at higher currents (1.5 mA and 2.0 mA) in young control animals (12-14 weeks) compared to older animals (28-32 weeks) (p &lt; 0.005 difference). We also demonstrate a significant CBF response at electrical field strengths &lt;5 mV/mm, which is an important consideration for eventual human studies. These CBF responses are also strongly influenced by the use of anesthesia compared to awake animals, the respiration control (i.e., intubated vs. spontaneous breathing), systemic factors (i.e., CO2), and local conduction within the blood vessels, which is mediated by pericytes and endothelial cells. Likewise, more detailed imaging/recording techniques may limit the field size from the entire brain to only a small region. We describe the use of extracranial electrodes for applying tACS stimulation, including both homemade and commercial electrode designs for rodents, the concurrent measurement of the CBF and intracranial electrical field using bilateral glass DC recording electrodes, and the imaging approaches. We are currently applying these techniques to implement a closed-loop format for augmenting the CBF in animal models of Alzheimer's disease and stroke.

We describe a protocol for assessing dose-response curves for extracranial stimulation in terms of brain electrical field measurements and a relevant biomarker-cerebral blood flow. Since this protocol involves invasive electrode placement into the brain, general anesthesia is needed, with spontaneous breathing preferred rather than controlled respirations.

Surgery for Stimulating Electrode Placement and Burr Hole Creation in Mouse

Begin by transferring the anesthetized animal to the stereotaxic frame, and then secure the head into the nose cone and ear bars. Place the probes for measuring the pulse, pulse oxygen saturation, blood pressure, and temperature of the animal. Apply eye ointment.Remove the hair with depilatory cream and aseptically clean the scalp with three passages of iodine and alcohol. For a terminal study, remove the scalp using surgical scissors and expose the skull at approximately three millimeters from the lamboid suture caudally and three millimeters frontal to the bregma. Excise the scalp parietally to expose the inner part of the temporal muscle on both sides.Then, remove any residual subcutaneous connective tissue so that the skull is clean and dry to apply the stimulating electrodes. Next, apply conductive gel to the side of the electrodes that will be in contact with the skull. Place the electrode on this temporal muscle and secure it with surgical super glue around the edge at intermittent spots.Then, apply lidocaine paste to the temporal muscle and scalp on both sides without disturbing the electrodes. Test the impedance of the extracranial stimulating electrodes. Then, place the mouse under a laser speckle imaging device without intracranial recording electrodes.To apply stimulation between the two skull tACS electrodes, use a commercial human compatible stimulating device that delivers a constant current. Before stimulation, obtain a clear baseline. Apply brief periods of on/off stimulation at various amplitudes on either side of the skull.Ensure a clear baseline after stimulation. After the extracranial stimulating electrodes are placed four millimeters laterally to each side of the skull, mark the position of the burr holes at two millimeters on each side of the midline, four millimeters apart from each other, and orthogonal to sagittal suture. Then, drill two burr holes for the glass electrodes.Fill these burr holes with sterile mineral oil to prevent current ingress into the skull from the extracranial electrodes. Then, fill pooled glass micro electrodes with 0.2 molar sodium chloride, and place them using a micro manipulator into the two burr holes placed laterally to the sagittal suture. Place the glass micro electrodes into the burr holes.Next, test the impedance of the extracranial stimulating electrodes after the burr hole placement to verify that these do not interfere with the current flow into the brain. To measure the cerebral blood flow resulting from extracranial stimulation, place the mouse under a laser speckle imaging device with intracranial recording electrodes. Once inserted into the brain, perform depth profiles at various symmetrical depths to ensure these glass micro electrodes are approximately one millimeter within the cerebral cortex.Use a digitizing system to record continuous data from the Doppler probes and micro electrodes over a sufficiently stable baseline duration. Then, apply on/off stimulation and test the extra cranial stimulation. For experiments to induce spreading depression, add a third burr hole on the right side of the skull, 1.5 millimeters rostral to coronal suture, and one millimeter lateral to posterior frontal suture.Fill this burr hole with KCL for later application. In response to low intensity tACS, data was obtained for the intracranial direct DC electrical recordings and the bilateral laser Doppler recordings of the cerebral blood flow. A small response was observed in response to a 0.75 milliampere stimulus, while a larger response was seen in response to a one milliamp stimulus.For both electrical and cerebral blood flow traces, the responses were asymmetrical between the right and left side of the skull. Laser speckle skull imaging of the cerebral blood flow during attacks showed increased blood flow in response to the stimulation, which was diffused evenly throughout the cortex. After the stimulation, the blood flow returned to baseline.