המחברים מודים מאוד על תמיכתם של פרסי מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) ו- BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), ופרס EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H). נתונים התומכים בפרסום זה זמינים באופן גלוי בכתובת: 10.25405/data.ncl.22232452. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר.

1. חיץ ליזט תאים והכנת מדיה
<ol><li>הכנת אגר YT+P 2x ובינוני<ol><li>הכינו אגר YT+P 2x על ידי מדידת 16 גרם/ליטר טריפטון, תמצית שמרים 10 גרם/ליטר, 5 גרם/ליטר NaCl, 40 מ"ל/ליטר, 1 M K 2, HPO 4, 22 מ"ל/ליטר, 1 M KH2PO4 ו-15 גרם/ליטר אגר. למרק YT+P 2x, עקבו אחר הרכב הקודם אך השמיטו את האגר.</li>
		<li>עיקור על ידי autoclaving 2x YT+P.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת חיץ S30A<ol><li>הכינו את חיץ S30A עם 5.88 גרם/ליטר מ"ג-גלוטמט, 12.195 גרם/ליטר K-גלוטמט ו-25 מ"ל/ליטר 2 M Tris, מותאם ל-pH 7.7 עם חומצה אצטית.</li>
		<li>אחסן את מאגר S30A בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע אחד.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת חיץ S30B<ol><li>הכינו את מאגר S30B עם 5.88 גרם/ליטר מ"ג-גלוטמט ו-12.195 גרם/ליטר K-גלוטמט, מותאם ל-pH 8.2 עם 2 M Tris.</li>
		<li>אחסן את מאגר S30B בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע אחד.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת תאים ליזט (פרוטוקול 4 ימים)
<ol><li>יום 1<ol><li>יוצקים את 2x YT+P לתוך צלחות אגר בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין.</li>
		<li>יש לפזר E. coli ממלאי גליצרול של -80°C, ולדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 2<ol><li>חסן מושבה אחת מצלחת 2x YT+P לתוך 400 מ"ל של 2x YT+P מרק (בתוספת אמפיצילין) בצלוחית 1 L מבולבלת.</li>
		<li>יש לדגור במשך 24 שעות ב-37°C עם רעידות של 220 סל"ד.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 3<ol><li>למדוד ולתעד את OD600 של תרבויות 24 שעות; צמיחה מספיקה ב OD600 של 3-4. הערה: קח aliquot 1 מ"ל של תרבית חיידקים, ולבצע דילול סדרתי עם בינוני (2x YT+P מרק) לפני מדידת OD600 ננומטר. אפשר את אפקט הדילול בעת חישוב OD600.</li>
		<li>מעבירים את התרבית באופן שווה בין בקבוקי צנטריפוגות 500 מ"ל מקוררים מראש.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 4,500 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן להשליך את supernatant.</li>
		<li>בזמן הצנטריפוגה, השלימו את הכנת חיץ S30A על ידי הוספת 2 מ"ל/ליטר של 1 M DTT למאגר S30A שהוכן קודם לכן, ערבוב ותחזוקה של החיץ על קרח.</li>
		<li>השהה מחדש את כדורי התא ב- 200 מ"ל של חיץ S30A.</li>
		<li>מערבבים את הבקבוקים במרץ עד שכל הגלולה מסיסה, תוך שמירה על התאים על קרח ככל האפשר.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 4,500 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן להשליך את supernatant.</li>
		<li>חזור על שלבים 2.3.5-2.3.7 (כולל).</li>
		<li>הוסיפו 40 מ"ל של חיץ S30A לכל בקבוק צנטריפוגה, השהו מחדש את הכדוריות והעבירו לצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל שנשקלו מראש.</li>
		<li>צנטריפוגה ב-4,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4°C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקאנט, והוציאו את שאריות הסופרנאטנט על ידי פיפטה, תוך שמירה על קרח ככל האפשר.</li>
		<li>לשקול מחדש את צינורות הצנטריפוגות, לרשום את המסה החדשה, ולחשב את המסה של הכדורים.</li>
		<li>להקפיא כדורי הבזק בחנקן נוזלי, ולאחסן אותם ב -80 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>יום 4<ol><li>הפשירו את הכדוריות על קרח.</li>
		<li>לכל 1 גרם של כדור, הוסף את הדברים הבאים: 1.2 מ"ל של חיץ S30A (DTT הוסיף לפני השימוש), 275 μL של מעכב פרוטאז (8 מ"מ מלאי), ו 25 μL של lysozyme (10 מ"ג / מ"ל מלאי).</li>
		<li>מערבלים במרץ עד שהכדורים מסיסים לחלוטין ללא גושים שנותרו, ושומרים אותם על קרח ככל האפשר.</li>
		<li>בצינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל, הפעל את מתלי התא ב-120 W, 20 kHz, 30% משרעת ו-20 s/40 s בפולסי הפעלה/כיבוי למשך 5 דקות של סוניקציה.</li>
		<li>צנטריפוגה במהירות 4,000 x גרם למשך שעה אחת ב-4°C כדי להשליך את פסולת התא.</li>
		<li>מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות צנטריפוגות טריים בנפח 50 מ"ל.</li>
		<li>צינורות הדגירה ב-37°C ב-220 סל"ד למשך 80 דקות.</li>
		<li>הכינו חומרי דיאליזה על ידי הוספת 1 מ"ל/ליטר של 1 M DTT למאגר S30B. מערבבים ומוסיפים 900 מ"ל לכד סטרילי של 1 ליטר. הוסיפו מערבל מגנטי ושמרו על טמפרטורה של 4°C.</li>
		<li>בעקבות תגובת הנגר, העבר את תמצית התא משלב 2.4.7 לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 2 מ"ל, וצנטריפוגה ב -20,000 x גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>אחדו את הסופרנאטנט נטול הכדוריות על קרח בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.</li>
		<li>קבע את הנפח הכולל של תמצית התאים המיוצרת, והלחלח את המספר הדרוש של קלטות דיאליזה MWCO 10K על ידי טבילתן ב- S30B למשך 2 דקות.</li>
		<li>לטעון את הקלטות באמצעות מזרק עם עד 3 מ"ל של תמצית. Dialyze עד שלוש קלטות לכל 1 ליטר beoaker, תוך ערבוב ב 4 ° C במשך 3 שעות.</li>
		<li>לאחר השלמת הדיאליזה, המבהירה את התמצית, מעבירים את התמצית לצינורות מיקרו-צנטריפוגות של 2 מ"ל. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.</li>
		<li>אחדו את התמצית המזוקקת לצינור צנטריפוגה טרי על קרח, וערבבו לזמן קצר כדי לערבב.</li>
		<li>לקבוע את ריכוז החלבון של תמצית באמצעות fluorometer.</li>
		<li>יש לדלל את התמצית לריכוז של 44.5 מ"ג/מ"ל באמצעות ddH2O מקורר מראש.</li>
		<li>Aliquot לתוך 200 μL aliquots, להקפיא הבזק בחנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת הידרוג'לים ליופיליים (שיטה A)
<ol><li>שוקלים 0.75 גרם אגרוז, מוסיפים ddH2O לנפח של 100 מ"ל, ומחממים במיקרוגל בהתפרצויות של 30 שניות בטמפרטורות גבוהות כדי ליצור מלאי אגרוז מותך.</li>
	<li>באמצעות פיפטה, להעביר 50 μL של agarose מותך לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, ולאפשר את הג'ל פילמור במשך 20-30 דקות (פילמור מתרחשת מהר יותר אם הג'לים מועברים למקרר).</li>
	<li>הקפיאו במהירות הבזק את צינורות המיקרוצנטריפוגה, המכילים את הג'לים הפולימריים, בחנקן נוזלי.</li>
	<li>הסירו את מכסה צינורות הצנטריפוגה, כסו את פתחי צינורות הצנטריפוגות בסרט שעווה ונקבו את הסרט מספר פעמים בעזרת מחט או קצה פיפטה.</li>
	<li>מעבירים את צינורות המיקרוצנטריפוגות המכילות את הג'לים הפולימריים לאחסון של -80°C למשך 1-2 שעות.</li>
	<li>שחזרו את צינורות הצנטריפוגות מאחסון של -80°C, והכניסו לייבוש בהקפאה, כדי להבטיח שהצינורות יבשים לחלוטין.</li>
	<li>הפעילו את מייבש ההקפאה עם ההגדרות הבאות: טמפרטורה: −20 °C, לחץ: 0.1 mbar.</li>
	<li>השאירו את הג'ל לייבוש בהקפאה למשך הלילה.</li>
	<li>החזירו את הג'לים ממייבש ההקפאה, והכניסו אותם לאחסון של -80°C עד לצורך. הערה: ניתן לאחסן ג'לים מיובשים בהקפאה עד שנה.</li>
</ol>4. הכנת מלאי תמיסות אנרגיה 14x
<ol><li>שלב את כל רכיבי התגובה (טבלה 1) בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל על קרח כדי ליצור תמיסת אנרגיה 14x.</li>
	<li>Aliquot את פתרון האנרגיה 14x לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל, ולאחסן ב -80 ° C (aliquots נפח קטן יותר ניתן להשתמש). הערה: ניתן לאחסן את תמיסת האנרגיה 14x למשך מספר חודשים בטמפרטורה של -80°C אם נמנעת הפשרה חוזרת ונשנית של הצינורות.</li>
</ol>5. הכנת מלאי חומצות אמינו 4x
<ol><li>הפשירו, על קרח, את כל 20 רכיבי חומצות האמינו של ערכת RTS Amino Acid Sampler. מערבלים את חומצות האמינו כדי להבטיח שהן מומסות לחלוטין.</li>
	<li>בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, מערבבים את כל 20 חומצות האמינו, ומוסיפים 12 מ"ל של מערבולת סטרילית ddH2O. עד שהתמיסה מתבהרת, עם אובך קל בלבד של צבע לבן.</li>
	<li>Aliquot את 4x חומצות אמינו לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge (500 μL aliquots).</li>
	<li>הקפיאו במהירות הבזק את תמיסת חומצות האמינו 4x aliquots בחנקן נוזלי, והעבירו את aliquots לאחסון של -80°C.</li>
</ol>6. כיול מאגר ללא תאים
הערה: מאגר CFPS המשמש לתגובות הידרוג'ל כויל לריכוזים אופטימליים של DTT, Mg-גלוטמט ו-K-גלוטמט בהתאם לפרוטוקול ב-Banks et al.34 שונה מ-Sun et al.35. הרכבי תגובת הכיול נבחרו בשיטת תכנון ניסויים (DOE), כאשר נבחרו שבע רמות גורם עבור K-גלוטמט (200 מילימול, 400 מילימול, 600 מילימול, 1,000 מילימול, 1,200 מילימול, 1,400 מילימול), מג-גלוטמט (0 מילימול, 10 מילימול, 20 מילימול, 30 מילימול, 40 מילימול, 50 מילימול, 60 מילימול) ו-DTT (0 מילימול, 5, 10 מילימול, 15 מילימול, 20 mM, 25 mM, 30 mM) מניות. JMP Pro 15 שימש ליצירת עיצוב DOE מותאם אישית (טבלה 2) ולביצוע הניתוח כדי לקבוע את ריכוזי הגורמים האופטימליים.
<ol><li>שחזרו את התמצית נטולת התאים מאחסון של -80°C, והפשירו על קרח.</li>
	<li>הפשירו את 4x חומצות אמינו, 14x תמיסת אנרגיה, 40% PEG-8000, פלסמיד DNA, 3 M K-גלוטמט, 100 mM Mg-גלוטמט, ו 100 mM DTT מלאי על קרח.</li>
	<li>צור תערובת אב לכיול על ידי שילוב של 12.5 μL של 4x חומצות אמינו, 3.57 μL של תמיסת האנרגיה 14x, 2.5 μL של 40% PEG-8000, 3 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ו-10 μL של תמצית נטולת תאים (44.5 מ"ג/מ"ל), וצור עד 35 μL לכל תגובה עם ddH2O.</li>
	<li>מפזרים את 35 μL של תערובת מאסטר לתוך בארות של צלחת microtiter שחור 384 באר.</li>
	<li>לאחר תכנון DOE, הוסף את הנפח המתאים של Mg-גלוטמט, K-גלוטמט ו- DTT לכל תגובה, יחד עם ddH2O כדי להפוך כל תגובה לעד 50 μL.</li>
	<li>העבר את צלחת המיקרוטיטר לקורא לוחות לצורך זיהוי וניתוח פלואורסצנטיות באמצעות הגדרות קורא הלוחות המתוארות (עבור mCherry): עירור: 587 ננומטר, פליטה: 610 ננומטר, רוחב פס אורך גל: 12 ננומטר, אופטיקה: למעלה, טמפרטורה: 37 ° C, עם קריאות פלואורסצנטיות נאספות כל 5 דקות במשך 4 שעות של זמן קריאה כולל. לדגור על הלוחות עם טלטול על הגדרת פולסים ב 60 סל"ד.</li>
	<li>להעלות את התוצאות לתכנון JMP DOE, וליצור פרופיל חיזוי כדי לקבוע את רמות הריכוז האופטימליות עבור K-גלוטמט, Mg-גלוטמט ו- DTT בהתבסס על משתני התגובה הרצויים; במקרה זה, הפלואורסצנטיות המקסימלית וקצב התגובה היו משתני התגובה.</li>
	<li>שלב את הריאגנטים כפי שמוצג בטבלה 3 כדי ליצור את מאגר 2X CFPS</li>
	<li>Aliquot ולאחסן ב -80 °C</li>
</ol>7. CFPS בהידרוג'לים ליופיליים מיובשים (שיטה A)
הערה: הפלסמידים המשמשים בתגובות CFPS נוצרו באמצעות רכיבים מערכת הכלים המודולרית EcoFlex עבור E. coli36 ותוארו ב- Whitfield et al.11 mCherry ו- eGFP היו תחת שליטתו של מקדם JM23100 המכונן. רכיבים אלה זמינים מ-Addgene.
<ol><li>שחזרו את התמצית נטולת התאים מאחסון של -80°C, והפשירו על קרח למשך כ-20 דקות.</li>
	<li>אספו את חיץ CFPS 2x ואת DNA פלסמיד, והפשירו על קרח.</li>
	<li>אספו את ההידרוג'לים המיובשים בהקפאה, ואפשרו להם להגיע לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות על ידי השארת הג'לים לעמוד על הספסל.</li>
	<li>מעבירים את הג'לים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, חותכים את הג'לים באזמל במידת הצורך כדי להתאים אותם לבארות.</li>
	<li>בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, לשלב 10 μL של תמצית ללא תאים עם 25 μL של 2x CFPS מאגר ו 4 מיקרוגרם של DNA פלסמיד; ליצור עד נפח כולל של 50 μL עם ddH2O כדי ליצור את פתרון CFPS.</li>
	<li>פיפטה את תמיסת CFPS על הידרוג'לים מיובשים בהקפאה.</li>
	<li>יש להשרות את הג'לים במערכת CFPS למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מעבירים את הג'לים לצלחת מיקרוטיטר שחורה בעלת 384 בארות בעזרת מרית.</li>
	<li>העבר את לוח המיקרוטיטר לקורא לוחות לצורך זיהוי וניתוח פלואורסצנטיות באמצעות הגדרות קורא הלוחות המתוארות בשלב 6.6. תוצאות מייצגות זמינות במחקרים קודמים31,33.</li>
</ol>8. סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים הניתנים לפריסה (שיטה B)
<ol><li>יש לשחזר תמצית נטולת תאים מאחסון של -80°C, ולהפשיר על קרח למשך כ-20 דקות.</li>
	<li>לאסוף את DNA פלסמיד, ולהפשיר על קרח.</li>
	<li>בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על קרח, שלב 10 μL של תמצית ללא תאים עם 3 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ו 25 μL של 2x CFPS חיץ היוצר עד נפח כולל של 37.5 μL.</li>
	<li>מדדו 3 גרם אגרוז, והוסיפו ל-100 מ"ל של חיץ ddH2O כדי ליצור 3% אגרוז.</li>
	<li>חממו במיקרוגל את 3% האגרוז בהתפרצויות של 30 שניות בעוצמה גבוהה.</li>
	<li>פיפטה 12.5 μL של אגרוז מותך לתוך 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגות המכילים CFPS לערבב לנפח כולל של 50 μL.</li>
	<li>אפשר agarose מותך להתקרר, אבל לא פולימריזציה, משאיר את agarose בלוק חום להגדיר 50 ° C.</li>
	<li>שלב את האגרוז המותך עם תמיסת CFPS; יש לערבב באמצעות פיפטינג וערבוב עם הקצה, ולהקפיד לנוע במהירות כדי למנוע פילמור ג'ל לפני שניתן יהיה לערבב את תמיסת CFPS.</li>
	<li>מניחים לג'לים להתקרר בטמפרטורת החדר ומתפלמרים במשך כ-2 דקות.</li>
	<li>מעבירים את האגרוז הפולימרי לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל עם מרית, ומקפיאים במהירות הבזק בחנקן נוזלי.</li>
	<li>הכניסו את ההידרוג'לים הקפואים במהירות הבזק לאחסון של -80°C למשך שעה אחת.</li>
	<li>לשחזר את הג'לים מאחסון; הסירו את מכסי צינורות המיקרוצנטריפוגה, כסו את הצינורות בסרט שעווה ונקבו את היריעה כדי לאפשר את ייבוש הלחות.</li>
	<li>הפעילו את מייבש ההקפאה עם ההגדרות הבאות: טמפרטורה: −20 °C, לחץ: 0.1 mbar, ייבוש בהקפאה למשך 18 שעות (למשך הלילה).</li>
	<li>אחסנו את מכשירי CFPS המיובשים בהקפאה באחסון של -80°C עד לשימוש.</li>
	<li>מכשירי CFPS מיובשים בהקפאה, עם נפח רטוב משוער של 50 μL, ניתן לייבש מחדש עם 50 μL של ddH2O ללא נוזל עודף. החזרת נוזלים אורכת כ-30 דקות.</li>
	<li>מעבירים את הג'לים לצלחת מיקרוטיטר שחורה בעלת 384 בארות בעזרת מרית.</li>
	<li>העבר את לוח המיקרוטיטר לקורא לוחות לצורך זיהוי וניתוח פלואורסצנטיות באמצעות הגדרות קורא הלוחות המתוארות בשלב 6.6. תוצאות מייצגות זמינות בפרסומים קודמים31,33.</li>
</ol>

הטמעת תגובות CFPS במגוון מטריצות הידרוג'ל

<ol>
	<li>Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Engineering+in+an+open+world.">Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world.</a> Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).</li><li>Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Engineering+beyond+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).</li><li>Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+enabled+rapid+prototyping+for+metabolic+engineering+and+synthetic+biology.">Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology.</a> Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).</li><li>Kopniczky, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+as+a+prototyping+platform+for+mammalian+synthetic+biology.">Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).</li><li>Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+cell-free+biosensors+to+monitor+enzymatic+production.">Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).</li><li>Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+cell-free+protein+synthesis+for+extending+the+abilities+of+biological+systems.">Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).</li><li>Focke, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+in+vitro+folding+with+cell+free+protein+synthesis+for+membrane+protein+expression.">Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression.</a> Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).</li><li>Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., B&#246;ckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+synthesis+of+complex+biomolecular+assemblies:+wheat+germ+cell-free+protein+expression+in+structural+biology.">Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).</li><li>Bashir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+concepts+of+hydrogels:+synthesis,+properties,+and+their+applications.">Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications.</a> Polymers. 12 (11), 2702 (2020).</li><li>Loo, S. L., V&#225;squez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+hydrogels-A+promising+platform+in+enhancing+water+security+for+a+sustainable+future.">Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future.</a> Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).</li><li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+materials.">Cell-free protein synthesis in hydrogel materials.</a> Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).</li><li>Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+strategies+for+adhesive+hydrogels+with+natural+antibacterial+agents+as+wound+dressings:+Status+and+trends.">Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends.</a> Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).</li><li>Musgrave, C. S. A., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+lens+materials:+A+materials+science+perspective.">Contact lens materials: A materials science perspective.</a> Materials. 12 (2), 261 (2019).</li><li>Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+hydrogel+from+baby+diaper+wastes+and+its+application+for+enhancing+soil+irrigation+management.">Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management.</a> Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).</li><li>Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+drug+delivery+systems:+A+review+of+current+characterization+and+evaluation+techniques.">Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).</li><li>Jacob, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+hydrogels+in+drug+delivery+systems,+tissue+engineering+and+wound+management.">Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management.</a> Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).</li><li>Senapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance.">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biocompatible,+stimuli-responsive,+and+injectable+hydrogel+with+triple+dynamic+bonds.">A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds.</a> Molecules. 25 (13), 3050 (2020).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactuators+based+on+stimulus-responsive+hydrogels+and+their+emerging+biomedical+applications.">Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications.</a> NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).</li><li>Fan, M., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+conjugation+for+biodegradable+hydrogels+as+drug+and+cell+scaffolds.">Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds.</a> Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).</li><li>Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+expression+and+in+situ+immobilization+of+proteins+for+generation+of+three-dimensional+protein+arrays+in+a+hydrogel+matrix.">In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix.</a> Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).</li><li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles:+Towards+artificial+cells.">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li><li>Huang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiobitsTM+explorer:+A+modular+synthetic+biology+education+kit.">BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit.</a> Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).</li><li>Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., Garc&#237;a-Guzm&#225;n, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+analysis+of+agarose-based+biopolymers+with+potential+use+in+regenerative+medicine.">Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine.</a> Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).</li><li>Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+on+recent+progress+of+the+hydrogels:+from+material+resources,+properties+to+functional+applications.">An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications.</a> Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).</li><li>Salati, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-based+biomaterials:+Opportunities+and+challenges+in+cartilage+tissue+engineering.">Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering.</a> Polymers. 12 (5), 1150 (2020).</li><li>Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+Synthetic+compartments+with+life-like+functionality+and+adaptivity.">Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).</li><li>Kahn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microgels+as+a+platform+for+cell-free+protein+expression+and+display.">DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transcription+and+translation+in+clay+hydrogel+and+implications+for+early+life+evolution.">Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution.</a> Scientific Reports. 3, 3165 (2013).</li><li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles:+Towards+artificial+cells.">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li><li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+genetic+devices+confer+autonomic+and+adaptive+properties+to+hydrogels.">Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+DNA+hydrogel:+Design,+synthesis+and+applications.">Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications.</a> Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).</li><li>Howard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Datasets+for+Whitfield+et+al.">Datasets for Whitfield et al.</a> 2020 Chemical Communications. , (2020).</li><li>Banks, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+reaction+components+affect+the+kinetics+and+performance+robustness+of+cell-free+protein+synthesis+reactions.">Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli-based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Moore, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EcoFlex:+A+multifunctional+MoClo+kit+for+E.+coli+synthetic+biology.">EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).</li><li>Ben&#237;tez-Mateos, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+&#181;-channels.">Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel &#181;-channels.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).</li></ol>

להלן שני פרוטוקולים לשילוב תגובות CFPS מבוססות תאי E. coli ליזט בהידרוג'לים של אגרוז. שיטות אלו מאפשרות ביטוי גנים בו זמנית בכל החומר. ניתן להתאים את הפרוטוקול למערכות CFPS אחרות והוא נערך בהצלחה עם ערכות CFPS זמינות מסחרית בנוסף לליזטים התאיים שהוכנו במעבדה המפורטים כאן. חשוב לציין כי הפרוטו?...

ביולוגיה סינתטית משלבת דיסציפלינות הנדסיות מגוונות כדי לתכנן ולהנדס חלקים, התקנים ומערכות מבוססי ביולוגיה שיכולים לבצע פונקציות שאינן נמצאות בטבע. רוב גישות הביולוגיה הסינתטית עדיין קשורות לתאים חיים. לעומת זאת, מערכות ביולוגיה סינתטית נטולות תאים מאפשרות רמות חסרות תקדים של שליטה וחופש בתכנון, ומאפשרות גמישות מוגברת וקיצור זמן להנדסת מערכות ביולוגיות תוך ביטול רבים מהאילוצים של שיטות מסורתיות לביטוי גנים מבוססי תאים 1,2,3. CFPS נמצא בשימוש במספר גדל והולך של יישומים על פני דיסציפלינות רבות, כולל בניית תאים מלאכותיים, אב טיפוס של מעגלים גנטיים, פיתוח biosensors, וייצור מטבוליטים 4,5,6. CFPS היה גם שימושי במיוחד לייצור חלבונים רקומביננטיים שאינם יכולים להתבטא בקלות בתאים חיים, כגון חלבונים נוטים לצבירה, חלבונים טרנסממברנליים וחלבונים רעילים 6,7,8.
CFPS מבוצע בדרך כלל בתגובות נוזליות. עם זאת, זה עשוי להגביל את פריסתם במצבים מסוימים, שכן כל מכשיר נוזלי ללא תאים חייב להיות כלול בתוך כלי תגובה. הרציונל לפיתוח השיטות שהוצגו כאן היה לספק פרוטוקולים חזקים להטמעת התקנים ביולוגיים סינתטיים נטולי תאים בהידרוג'לים, לא כפלטפורמה לייצור חלבונים כשלעצמה, אלא לאפשר שימוש בהידרוג'לים כמארז פיזי לפריסת התקנים נטולי תאים מעבר למעבדה. לשימוש בהידרוג'לים כמארז CFPS יש מספר יתרונות. הידרוג'לים הם חומרים פולימריים שלמרות תכולת מים גבוהה (לפעמים מעל 98%), הם בעלי תכונות מוצקות 9,10,11. יש להם שימושים כמו משחות, חומרי סיכה ודבקים והם נמצאים במוצרים מגוונים כמו עדשות מגע, תחבושות פצעים, סרטי דבק ימיים, משפרי קרקע וחיתולים לתינוקות 9,11,12,13,14. הידרוג'לים נמצאים גם הם תחת חקירה פעילה כרכבי משלוח סמים 9,15,16,17. הידרוג'לים עשויים גם להיות תואמים ביולוגית, מתכלים, ויש להם כמה תגובות גירוי משלהם 9,18,19,20. לכן, המטרה כאן היא ליצור סינרגיה בין פונקציונליות הנגזרת מביולוגיה מולקולרית לבין מדע החומרים. לשם כך נעשו מאמצים לשלב ביולוגיה סינתטית נטולת תאים עם מגוון חומרים, כולל קולגן, לפוניט, פוליאקרילאמיד, פיברין, פפטיד PEG ואגרוז 11,21,22, כמו גם לצפות משטחי זכוכית, נייר ובד 11,23,24 עם מכשירי CFPS. הפרוטוקולים המוצגים כאן מדגימים שתי שיטות להטמעת תגובות CFPS במטריצות הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו (כלומר, >1 מ"מ), תוך שימוש באגרוז כחומר לדוגמה. אגרוז נבחרה בשל יכולת ספיגת המים הגבוהה שלה, תכונות הג'ל העצמי המבוקרות והתכונות המכניות הניתנות לכוונון 11,24,25,26. Agarose תומך גם CFPS פונקציונלי, הוא זול יותר מאשר חלופות הידרוג'ל רבות אחרות, והוא מתכלה, מה שהופך אותו בחירה אטרקטיבית כמערכת מודל ניסיוני. עם זאת, שיטות אלה הוכחו בעבר כמתאימות להטמעת CFPS במגוון הידרוג'לים חלופיים11. בהתחשב במגוון הרחב של יישומים של הידרוג'לים ואת הפונקציונליות של CFPS, השיטות שהודגמו כאן יכול לספק בסיס שממנו החוקרים מסוגלים לפתח חומרי הידרוג'ל משופרים ביולוגית המתאימים למטרותיהם.
במחקרים קודמים, מערכות מיקרוג'ל בטווח גדלים של 1 מיקרומטר עד 400 מיקרומטר שימשו לביצוע CFPS בהידרוג'לים השקועים בחיץ תגובה 23,27,28,29,30,31. עם זאת, הדרישה לטבול הידרוג'לים בתוך מאגרי התגובה של CFPS מגבילה את ההזדמנויות לפריסתם כחומרים בפני עצמם. הפרוטוקולים המוצגים כאן מאפשרים לתגובות CFPS להתרחש בתוך הידרוג'לים ללא צורך להטביע את הג'לים במאגרי תגובה. שנית, השימוש בג'לים בקנה מידה מאקרו (בין 2 מ"מ ל-10 מ"מ) מאפשר לחקור את האינטראקציה הפיזית בין הידרוג'לים לבין ביטוי גנים נטולי תאים. לדוגמה, באמצעות טכניקה זו, ניתן ללמוד כיצד מטריצת הידרוג'ל משפיעה על תגובות CFPS11 וכיצד תגובות CFPS יכולות להשפיע על מטריצת הידרוג'ל31. גדלים גדולים יותר של הידרוג'לים מאפשרים גם פיתוח של חומרים חדשניים הניתנים לתכנות ביולוגי32. לבסוף, על ידי הטמעת תגובות CFPS לתוך הידרוג'לים, יש גם הפחתה פוטנציאלית בדרישה לכלי תגובה פלסטיים. עבור פריסת חיישנים ללא תאים, יש לכך יתרונות ברורים על פני מכשירים התלויים בתוכנות פלסטיק. יחד, הטמעת תגובות CFPS בהידרוג'לים מספקת מספר יתרונות לפריסה של התקנים נטולי תאים מעבר למעבדה.
המטרה הכוללת של השיטות המוצגות כאן היא לאפשר פעולה של תגובות CFPS בתוך מטריצות הידרוג'ל. שתי שיטות שונות מודגמות להטמעת תגובות ייצור חלבון ללא תאים בחומרי הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו (איור 1). בשיטה A, רכיבי CFPS מוכנסים להידרוג'ל אגרוז ליופילי כדי ליצור מערכת פעילה. בשיטה B, אגרוז מותך מעורבב עם רכיבי תגובת CFPS כדי ליצור מערכת הידרוג'ל CFPS שלמה, אשר לאחר מכן עוברת ליופיליזציה ומאוחסנת עד לצורך. מערכות אלה יכולות להיות מיובשות מחדש עם נפח של מים או חיץ ולנתח כדי להתחיל את התגובה.
מחקר זה משתמש במערכות מבוססות תאי ליזט Escherichia coli. אלו הן חלק ממערכות CFPS הניסיוניות הפופולריות ביותר, שכן הכנת תאי אי קולי ליזט היא פשוטה, זולה ומשיגה תפוקות חלבון גבוהות. ליזט התא משלים עם המרכיבים המקרומולקולריים הדרושים לביצוע שעתוק ותרגום, כולל ריבוזומים, tRNAs, סינתזות אמינואציל-tRNA, וגורמי ייזום, התארכות וסיום. באופן ספציפי, מאמר זה מדגים את הייצור של eGFP ו mCherry בהידרוג'לים agarose באמצעות תאי E. coli lysates ועוקב אחר המראה של פלואורסצנטיות באמצעות קורא לוחות ומיקרוסקופ קונפוקלי. תוצאות מייצגות עבור קורא לוחות microtiter ניתן לראות Whitfield et al.31, ואת הנתונים הבסיסיים זמינים לציבור 33. יתר על כן, הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים לאורך הג'לים מאושר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. שני הפרוטוקולים שהודגמו במאמר זה מאפשרים הרכבה ואחסון של התקנים גנטיים מבוססי CFPS במאטריה במטרה הסופית ליצור סביבה פיזית מתאימה להפצה של מעגלי גנים נטולי תאים באופן התומך בפריסת השדה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-214793B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10752.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Severn Biotech</td>
			<td>30-15-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino Acid Sampler Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BTRABR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J14121.MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NG01208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>757551-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD037-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein concentration kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rossetta 2 DE 3 E.coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71397-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J23160.MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS4323-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K MWCO dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge bottles</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3120-9500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer</td>
			<td>Christ</td>
			<td>part no. 101521, 101522, 101527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H-X3R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 384 well microtitre plates</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>222S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elga Purelab Chorus</td>
			<td>Elga</td>
			<td>#####</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5425R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP00532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP license</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15353518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photospectrometer (Biophotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>16713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>#####</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16384738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator (Sonicator)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12893543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Static Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MIR-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and needles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Lux platereader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00GD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Cole-parmer</td>
			<td>OU-04724-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/&#176;c meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>662-1657</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogels

רשתות גנים סינתטיות מספקות פלטפורמה למדענים ומהנדסים לתכנן ולבנות מערכות חדשניות עם פונקציונליות המקודדת ברמה גנטית. בעוד הפרדיגמה השלטת לפריסת רשתות גנים היא בתוך שלדה תאית, רשתות גנים סינתטיות עשויות להיות פרוסות גם בסביבות נטולות תאים. יישומים מבטיחים של רשתות גנים נטולות תאים כוללים ביו-חיישנים, שכן התקנים אלה הוכחו נגד מטרות ביוטיות (נגיפי אבולה, זיקה ו-SARS-CoV-2) וא-ביוטיות (מתכות כבדות, סולפידים, חומרי הדברה ומזהמים אורגניים אחרים). מערכות נטולות תאים נפרסות בדרך כלל בצורה נוזלית בתוך כלי תגובה. היכולת להטמיע תגובות כאלה במטריצה פיזיקלית, לעומת זאת, עשויה להקל על היישום הרחב יותר שלהן בקבוצה רחבה יותר של סביבות. לשם כך פותחו שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) במגוון מטריצות הידרוג'ל. אחד המאפיינים העיקריים של הידרוג'לים התורמים לעבודה זו הוא יכולת הבנייה מחדש של מים גבוהים של חומרי הידרוג'ל. בנוסף, הידרוג'לים הם בעלי מאפיינים פיזיקליים וכימיים המועילים מבחינה תפקודית. ניתן לייבש הידרוג'לים בהקפאה לאחסון ולהתייבש מחדש לשימוש מאוחר יותר. מוצגים שני פרוטוקולים שלב אחר שלב להכללה ובדיקה של תגובות CFPS בהידרוג'לים. ראשית, ניתן לשלב מערכת CFPS בהידרוג'ל באמצעות התייבשות עם ליזט תא. לאחר מכן ניתן להשרות או לבטא את המערכת בתוך ההידרוג'ל באופן קונסטיטוטיבי לביטוי חלבוני מלא באמצעות ההידרוג'ל. שנית, ניתן להחדיר לליזט התא הידרוג'ל בנקודת הפילמור, וניתן לייבש את המערכת כולה בהקפאה ולהתייבש מחדש בנקודה מאוחרת יותר באמצעות תמיסה מימית המכילה את השראת מערכת הביטוי המקודדת בתוך ההידרוג'ל. לשיטות אלה יש פוטנציאל לאפשר רשתות גנים נטולות תאים המקנות יכולות חושיות לחומרי הידרוג'ל, עם פוטנציאל לפריסה מעבר למעבדה.

Synthetic biology integrates diverse engineering disciplines to design and engineer biologically based parts, devices, and systems that can perform functions that are not found in nature. Most synthetic biology approaches are still bound to living cells. By contrast, cell-free synthetic biology systems facilitate unprecedented levels of control and freedom in design, enabling increased flexibility and a shortened time for engineering biological systems while eliminating many of the constraints of traditional cell-based gene expression methods1,2,3. CFPS is being used in an increasing number of applications across numerous disciplines, including constructing artificial cells, prototyping genetic circuits, developing biosensors, and producing metabolites4,5,6. CFPS has also been particularly useful for producing recombinant proteins that cannot be readily expressed in living cells, such as aggregation-prone proteins, transmembrane proteins, and toxic proteins6,7,8.
CFPS is typically performed in liquid reactions. This, however, may restrict their deployment in some situations, as any liquid cell-free device must be contained within a reaction vessel. The rationale for the development of the methods presented here was to provide robust protocols for embedding cell-free synthetic biology devices into hydrogels, not as a protein production platform per se but, instead, to allow the use of hydrogels as a physical chassis for the deployment of cell-free devices beyond the laboratory. The use of hydrogels as CFPS chassis has several advantages. Hydrogels are polymeric materials that, despite a high water content (sometimes in excess of 98%), possess solid properties9,10,11. They have uses as pastes, lubricants, and adhesives and are present in products as diverse as contact lenses, wound dressings, marine adhesive tapes, soil improvers, and baby diapers9,11,12,13,14. Hydrogels are also under active investigation as drug delivery vehicles9,15,16,17. Hydrogels may also be biocompatible, biodegradable, and possess some stimuli responses of their own9,18,19,20. Therefore, the goal here is to create a synergy between molecular biology-derived functionality and materials science. To this end, efforts have been made to integrate cell-free synthetic biology with a range of materials, including collagen, laponite, polyacrylamide, fibrin, PEG-peptide, and agarose11,21,22, as well as to coat surfaces of glass, paper, and cloth11,23,24 with CFPS devices. The protocols presented here demonstrate two methods for embedding CFPS reactions in macro-scale (i.e., &#62;1 mm) hydrogel matrices, using agarose as the exemplar material. Agarose was chosen due to its high water absorption capacity, controlled self-gelling properties, and tuneable mechanical properties11,24,25,26. Agarose also supports functional CFPS, is cheaper than many other hydrogel alternatives, and is biodegradable, making it an attractive choice as an experimental model system. These methods have, however, been previously demonstrated as appropriate for embedding CFPS in a range of alternative hydrogels11. Considering the wide range of applications of hydrogels and the functionality of CFPS, the methods demonstrated here can provide a basis from which researchers are able to develop biologically enhanced hydrogel materials suited to their own ends.
In previous studies, microgel systems with a size range of 1 &#181;m to 400 &#181;m have been used to perform CFPS in hydrogels submerged in reaction buffer23,27,28,29,30,31. The requirement to submerge hydrogels within CFPS reaction buffers, however, limits opportunities for their deployment as materials in their own right. The protocols presented here allow CFPS reactions to occur within hydrogels without the need to submerge the gels in reaction buffers. Second, the use of macroscale gels (between 2 mm and 10 mm in size) allows the study of the physical interaction between hydrogels and cell-free gene expression. For example, with this technique, it is possible to study how the hydrogel matrix affects CFPS reactions11 and how CFPS reactions can impact the hydrogel matrix31. Larger sizes of hydrogels also allow for the development of novel, bio-programmable materials32. Finally, by embedding CFPS reactions into hydrogels, there is also a potential reduction in the requirement for plastic reaction vessels. For the deployment of cell-free sensors, this has clear advantages over devices dependent on plasticware. Taken together, embedding CFPS reactions in hydrogels provides several advantages for the deployment of cell-free devices beyond the laboratory.
The overall goal of the methods presented here is to allow the operation of CFPS reactions within hydrogel matrices. Two different methods are demonstrated for embedding cell-free protein production reactions in macro-scale hydrogel materials (Figure 1). In Method A, CFPS components are introduced to lyophilized agarose hydrogels to form an active system. In Method B, molten agarose is mixed with CFPS reaction components to form a complete CFPS hydrogel system, which is then lyophilized and stored until needed. These systems can be rehydrated with a volume of water or buffer and analyte to commence the reaction.
This study uses Escherichia coli cell lysate-based systems. These are some of the most popular experimental CFPS systems, as E. coli cell lysate preparation is simple, inexpensive, and achieves high protein yields. The cell lysate is complemented with the macromolecular components needed to perform transcription and translation, including ribosomes, tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases, and initiation, elongation, and termination factors. Specifically, this paper demonstrates the production of eGFP and mCherry in agarose hydrogels using E. coli cell lysates and monitors the appearance of fluorescence using a plate reader and confocal microscopy. Representative results for the microtiter plate reader can be seen in Whitfield et al.31, and the underlying data are publicly available33. Further, the expression of fluorescent proteins throughout the gels is confirmed using confocal microscopy. The two protocols demonstrated in this paper allow for the assembly and storage of CFPS-based genetic devices in materia with the ultimate goal of creating a suitable physical environment for the distribution of cell-free gene circuitry in a manner supportive of field deployment.

מחבר זרקור: גישה חדשנית להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים 

שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים בקנה מידה מאקרו

We know living systems continuously integrate information from many different sources and that these signals trigger complex and subtle responses. Much of this information processing occurs at the molecular level. We're interested in operating these processes within materials, but without cells.The purpose is to give materials novel functionality. Challenges in this work are primarily associated with the cell-free protein synthesis reaction, rather than working with hydrogel. Cell reaction require high quality cell lysate as well as high quality and purity DNA to function well.This protocol allows researchers to embed molecular biology reactions into a physical biodegradable material that can be taken outside of the laboratory. Also, because the reaction output interacts directly with the material chassis, there is potential for the development of materials with novel sensing and response capabilities. In short-term, we see these methods as providing a novel route to the deployment of cell-free diagnostic devices.This protocol allows a number of devices to be created and spatially organized in a manner that is not possible for liquid reactions. Our future interests are twofold. First, we are interested in expanding the nature of the hydrogels we use to bring more material functionality to the work.Second, we are interested in increasing the complexity and performance of the gene networks we operate in gels, expanding the biological functionality of these systems.

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות להטמעת תגובות CFPS במטריצות הידרוג'ל, כאשר איור 1 מציג סקירה סכמטית של שתי הגישות. שתי השיטות מקובלות לייבוש בהקפאה ואחסון לטווח ארוך. שיטה א' היא המתודולוגיה הנפוצה ביותר משתי סיבות. ראשית, היא הוכחה כשיטה הישימה ביותר לעבודה עם מגוון חומרי הידרוג'ל...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Approach for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Hydrogels at JoVE.com

במאמר זה אנו מציגים שני פרוטוקולים להטמעת תגובות סינתזת חלבונים נטולי תאים במטריצות הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו ללא צורך בפאזה נוזלית חיצונית.

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...

אנו יודעים שמערכות חיות משלבות מידע ממקורות רבים ושונים, ושהאותות האלה מעוררים תגובות מורכבות ומעודנות. חלק גדול מעיבוד המידע הזה מתרחש ברמה המולקולרית. אנחנו מעוניינים להפעיל את התהליכים האלה בתוך חומרים, אבל בלי תאים.המטרה היא לתת לחומרים פונקציונליות חדשנית. אתגרים בעבודה זו קשורים בעיקר לתגובת סינתזת חלבונים ללא תאים, ולא לעבודה עם הידרוג'ל. תגובת תאים דורשת ליזט תאי באיכות גבוהה, כמו גם DNA איכותי וטהור כדי לתפקד היטב.פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להטמיע תגובות ביולוגיות מולקולריות בחומר פיזיקלי מתכלה שניתן לקחת מחוץ למעבדה. כמו כן, מכיוון שפלט התגובה מקיים אינטראקציה ישירה עם שלדת החומר, קיים פוטנציאל לפיתוח חומרים בעלי יכולות חישה ותגובה חדשניות. בטווח הקצר, אנו רואים שיטות אלה כמספקות נתיב חדשני לפריסה של מכשירי אבחון נטולי תאים.פרוטוקול זה מאפשר ליצור מספר התקנים ולארגן אותם מרחבית באופן שאינו אפשרי לתגובות נוזליות. האינטרסים העתידיים שלנו הם כפולים. ראשית, אנו מעוניינים להרחיב את אופי ההידרוג'לים בהם אנו משתמשים כדי להביא יותר פונקציונליות חומרית לעבודה.שנית, אנו מעוניינים להגדיל את המורכבות והביצועים של רשתות הגנים שאנו מפעילים בג'לים, ולהרחיב את הפונקציונליות הביולוגית של מערכות אלה.

methods-for-embedding-cell-free-protein-synthesis-reactions-macro

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

874 Views.  Newcastle University. אנו יודעים שמערכות חיות משלבות מידע ממקורות רבים ושונים, ושהאותות האלה מעוררים תגובות מורכבות ומעודנות. חלק גדול מעיבוד המידע הזה מתרחש ברמה המולקולרית. אנחנו מעוניינים להפעיל את התהליכים האלה בתוך חומרים, אבל בלי תאים.המטרה היא לתת לחומרים פונקציונליות חדשנית. אתגרי?...

Video: מחבר זרקור: גישה חדשנית להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים 

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. While the dominant paradigm for the deployment of gene networks is within a cellular chassis, synthetic gene networks may also be deployed in cell-free environments. Promising applications of cell-free gene networks include biosensors, as these devices have been demonstrated against biotic (Ebola, Zika, and SARS-CoV-2 viruses) and abiotic (heavy metals, sulfides, pesticides, and other organic contaminants) targets. Cell-free systems are typically deployed in liquid form within a reaction vessel. Being able to embed such reactions in a physical matrix, however, may facilitate their broader application in a wider set of environments. To this end, methods for embedding cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in a variety of hydrogel matrices have been developed. One of the key properties of hydrogels conducive to this work is the high-water reconstitution capacity of hydrogel materials. Additionally, hydrogels possess physical and chemical characteristics that are functionally beneficial. Hydrogels can be freeze-dried for storage and rehydrated for use later. Two step-by-step protocols for the inclusion and assay of CFPS reactions in hydrogels are presented. First, a CFPS system can be incorporated into a hydrogel via rehydration with a cell lysate. The system within the hydrogel can then be induced or expressed constitutively for complete protein expression through the hydrogel. Second, cell lysate can be introduced to a hydrogel at the point of polymerization, and the entire system can be freeze-dried and rehydrated at a later point with an aqueous solution containing the inducer for the expression system encoded within the hydrogel. These methods have the potential to allow for cell-free gene networks that confer sensory capabilities to hydrogel materials, with the potential for deployment beyond the laboratory.

Here, we present two protocols for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogel matrices without the need for an external liquid phase.

Cell-Free Protein Synthesis in Rehydrated Lyophilized Hydrogels

To begin, transfer the hydrogels to 1.5 milliliter micro centrifuge tubes, trimming the gels with a scalpel if necessary to make them fit in the wells. In another 1.5 milliliter micro centrifuge tube, combine 10 microliters of the cell-free extract with 25 microliters of two x cell-free protein synthesis buffer and four micrograms of plasmid DNA. Make up to a total volume of 50 microliters with double distilled water to prepare the cell-free protein synthesis solution.Pipette the solution onto the freeze dried hydrogels, and allow the gels to soak in the cell-free protein synthesis system for five to 10 minutes at room temperature. Transfer the gels to a black 384 well microtiter plate using a spatula. Then, transfer the microtiter plate to a plate reader, and use the plate reader settings shown on the screen for fluorescence detection and analysis.

סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים ליופיליים מיובשים

Cell-Free Protein Synthesis in Deployable Hydrogels

In a 1.5 milliliter microcentrifuge tube on ice, combine 10 microliters of the cell-free extract with four micrograms of plasmid DNA and 25 microliters of 2X cell-free protein synthesis buffer. Make up to a total volume of 50 microliters with double-distilled water to prepare the cell-free protein synthesis solution. Weigh 0.75 grams of agarose and add it to 100 milliliters of double-distilled water buffer to prepare 0.75%agarose.Microwave the 0.75%agarose in 30-second bursts at high power and pipette 50 microliters of the molten agarose into 1.5-milliliter microcentrifuge tubes or into molds of a desired shape. Place the molten agarose on a heat block set to 50 degrees Celsius and allow the agarose to cool but not polymerize. Then, mix the molten agarose with the cell-free protein synthesis solution by pipetting and stirring with the pipette tip.Allow the gels to cool to room temperature and polymerize for approximately two minutes. Transfer the polymerized agarose to 1.5-milliliter microcentrifuge tubes with a spatula and flash freeze in liquid nitrogen. Place the flash-frozen hydrogels into minus 80 degrees Celsius storage for one hour.After that, remove the microcentrifuge tube lids. Cover the tubes with a wax film and pierce the film to allow the moisture to be dried off. Set the temperature of the freeze dryer to minus 20 degrees Celsius and pressure to 0.1 millibars and freeze-dry the cell-free protein synthesis devices for 18 hours or overnight.Rehydrate the freeze-dried devices for 30 minutes with 50 microliters of double-distilled water without excess liquid, and transfer the gels to a black 384-well microtiter plate using a spatula. Finally, place the microtiter plate on a plate reader and use the plate reader settings shown on the screen for fluorescence detection and analysis. The cell-free protein synthesis of eGFP and mCherry in a hydrogel using E.coli cell lysates is shown in this figure.0.75%agarose gels were prepared without DNA template with four micrograms of either eGFP or mCherry template or with four micrograms of both eGFP and mCherry template. An overlay of the two channels is also shown, and the overlay includes the differential interference contrast image. The results confirmed the co-expression of both mCherry and eGFP in agarose.