עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין, מענק מס '81930031, 81901525. בנוסף, אנו מודים לטיינג'ין Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. על שסיפקה לנו מכונות והדרכה טכנית.

איסוף דגימות האדם אושר על ידי ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים הכללי של האוניברסיטה הרפואית בטיאן-ג'ין. איסוף הדם הוורידי האנושי עקב בקפדנות אחר ההנחיה שפורסמה על ידי ועדת הבריאות הלאומית של סין, כלומר WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. בקצרה, נאסף דם מאנשים בריאים בהסכמה מדעת מווריד האזור הברכיאלי הקדמי, והדגימות עורבבו באמצעות נוגד קרישה נתרן ציטראט 3.2% ביחס של 1:9. כאשר נאספו רק דגימות נוגדות קרישה של נתרן ציטראט, כלי האיסוף הראשון הושלך לפח. זרימת העיבוד החלה תוך 0.5 שעות מאיסוף הדגימה. נבדקים בריאים בוגרים גויסו לאיסוף דגימות לאחר קבלת הסכמה מדעת. קריטריוני אי הכללת המטופל היו: (1) פקקת תוך וסקולרית לאחרונה, (2) פגיעה בתפקוד הכבד והכליות, (3) יתר לחץ דם, היפרליפידמיה, סוכרת ומחלות כרוניות אחרות, (4) טיפול באספירין או נוגדי קרישה, (5) וסת והריון.
1. בידוד פלזמה עשירה ברכב חשמלי
<ol><li>צנטריפוגה את הדגימות ב 120 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר תאי דם. הסופרנאטנט הוא פלזמה עשירה בטסיות. לאחר מכן, מעבירים את ה-1/2 העליון של הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש עם פיפטה.</li>
	<li>צנטריפוגה את הפלזמה עשירה טסיות ב 1500 x גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את טסיות. הסופרנאטנט הוא פלזמה ענייה בטסיות. לאחר מכן מעבירים את ה-1/2 העליון של הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש.</li>
	<li>צנטריפוגה את הפלזמה ענייה טסיות ב 13000 x גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר פסולת התא. הסופרנאטנט הוא פלזמה עשירה ב-EV. לאחר מכן, העבירו את ה-1/2 העליון של הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה חדש לבדיקה הבאה.</li>
</ol>2. זיהוי EV-ACT של הדגימה על ידי המנתח
<ol><li>הפעל את מנתח הקריש (ראה טבלת חומרים) וחמם את המכשיר ל- 37 מעלות צלזיוס. התקן את הבדיקה החד פעמית ואת הבדיקה ולאחר מכן התחל את הליך בקרת האיכות של המכונה. הערה: כאשר ערך אות ההתנגדות הצמיגה על המסך מוצג כקו ישר, פירוש הדבר שהזיהוי אינו מופרע ובקרת האיכות של מצב המנתח מוסמכת. ניתן להתחיל בהליך הבדיקה לאחר אישור הבדיקה העצמית.</li>
	<li>הזן מידע לדוגמה במערכת. לאחר מכן, העבירו 200 מיקרוליטר של פלזמה עשירה ברכב חשמלי לכוס הבדיקה, ולאחר מכן 20 מילימטר 170 מיקרוליטר של סידן כלורי. לחץ על לחצן התחל. מוט הערבוב המגנטי בכוס הבדיקה יערבב באופן מלא את הדגימה עם סידן כלורי. סגור את הכיסוי, והבדיקה תתחיל לזהות את השינוי בהתנגדות הדגימה. הערה: לאחר סיום הבדיקה, המנתח יבקש באופן אוטומטי "הבדיקה הושלמה". הזמן של EV-ACT מוצג ונרשם על ידי המערכת. התוצאה באה לידי ביטוי ביחידת הזמן "שנייה". השליכו את הבדיקה ובדקו את הכוס.</li>
</ol>3. בקרת איכות מבוססת ציטומטריה של זרימה של דגימת פלזמה עשירה ברכב חשמלי
<ol><li>כלי רכב חשמליים זוהו לראשונה לפי גודלם (0.1-1 מיקרומטר). התאם מראש את הפרמטרים של ציטומטר הזרימה והגדר את "השער" של EV באמצעות חרוזי פוליסטירן הזמינים מסחרית (0.5, 0.9 ו- 3.0 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים). הערה: תערובת החרוזים מורכבת מכדורי פלורסנט בקטרים שונים המכסים את טווח הגדלים של מיקרו-שלפוחיות (0.5 ו-0.9 מיקרומטר) וטסיות דם (0.9 מיקרומטר ו-3 מיקרומטר).</li>
	<li>כוונן את המתח של הפיזור הקדמי והפיזור הצדדי, וודא שהמיקרוספרות בגודל 0.9 מיקרומטר נופלות באזור המתאים. ניתן לצייר את אזור הרכב החשמלי על פי קוטר המיקרספרה.</li>
	<li>העבירו 50 μL של פלזמה עשירה ב-EV לתוך צינור הזרימה, ולאחר מכן 450 μL של מלח חיץ פוספט מסונן. מערבבים היטב את הנוזל בצינור הזרימה. לבסוף, זהה את הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה25.</li>
	<li>השתמש בחלקיקים פלואורסצנטיים של קשת אולטרה (ראה טבלת חומרים) כדי לכמת את מספר EVs.In הקצר, הוסף 10 μL של החלקיקים לדגימה לפני זיהוי הזרימה, וחשב את ריכוז EV באמצעות הנוסחה הבאה לאחר השלמת זיהוי הדגימה: 10,120 * EV (#) / (microbeads * נפח) * גורם דילול26.</li>
</ol>

הערכת קרישת יתר בדם של פלזמה עשירה ברכב חשמלי

<ol>
	<li>Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulopathy+induced+by+traumatic+brain+injury:+systemic+manifestation+of+a+localized+injury.">Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury.</a> Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).</li><li>Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prothrombotic+state+associated+with+preeclampsia.">Prothrombotic state associated with preeclampsia.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).</li><li>Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+thrombosis+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).</li><li>You, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypercoagulability+with+thrombelastography+in+patients+with+hip+fracture+receiving+thromboprophylaxis.">Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis.</a> Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).</li><li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease.">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).</li><li>Zang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-derived+microparticles+as+novel+biomarkers+for+the+diagnosis+of+deep+venous+thrombosis+in+trauma+patients.">Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V(-)+and+tissue+factor(+)+microparticles+as+biomarkers+for+predicting+deep+vein+thrombosis+in+patients+after+joint+arthroplasty.">Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty.</a> Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).</li><li>Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microparticles+in+the+pathogenesis+and+early+anticoagulation+of+thrombosis+in+COVID-19+with+kidney+injury.">Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).</li><li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis.">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).</li><li>Cointe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+microparticle+enumeration+across+different+flow+cytometry+platforms:+results+of+a+multicenter+collaborative+workshop.">Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).</li><li>Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procoagulant+and+platelet-derived+microvesicle+absolute+counts+determined+by+flow+cytometry+correlates+with+a+measurement+of+their+functional+capacity.">Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).</li><li>Mooberry, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procoagulant+microparticles+promote+coagulation+in+a+factor+XI-dependent+manner+in+human+endotoxemia.">Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+microparticles+and+pathophysiology+of+traumatic+brain+injury.">Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Protein &amp; Cell. 8 (11), 801-810 (2017).</li><li>Bolliger, D., Tanaka, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+coagulation+testing+in+cardiac+surgery.">Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).</li><li>Ganter, M. T., Hofer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coagulation+monitoring:+current+techniques+and+clinical+use+of+viscoelastic+point-of-care+coagulation+devices.">Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices.</a> Anesthesia &amp; Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).</li><li>Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+assessment+of+the+anticoagulant+activity+of+direct+oral+anticoagulants:+a+systematic+review.">Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review.</a> Chest. 151 (1), 127-138 (2017).</li><li>Maier, C. L., Sniecinski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticoagulation+monitoring+for+perioperative+physicians.">Anticoagulation monitoring for perioperative physicians.</a> Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).</li><li>Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+method+of+in+vivo+evaluation+of+hemostasis:+Spatial+thrombodynamics.">The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics.</a> Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).</li><li>Tsantes, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+coagulation+activity+in+hip+fracture+patients:+A+case-control+study+using+rotational+thromboelastometry.">Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry.</a> International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).</li><li>Premkumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COVID-19-related+dynamic+coagulation+disturbances+and+anticoagulation+strategies+using+conventional+D-dimer+and+point-of-care+Sonoclot+tests:+a+prospective+cohort+study.">COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study.</a> BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).</li><li>Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+thromboelastography+and+thromboelastometry.">Comparison between thromboelastography and thromboelastometry.</a> Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).</li><li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMEM16F+mediated+phosphatidylserine+exposure+and+microparticle+release+on+erythrocyte+contribute+to+hypercoagulable+state+in+hyperuricemia.">TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).</li><li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperuricemia+enhances+procoagulant+activity+of+vascular+endothelial+cells+through+TMEM16F+regulated+phosphatidylserine+exposure+and+microparticle+release.">Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release.</a> The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MPs-ACT,+an+assay+to+evaluate+the+procoagulant+activity+of+microparticles.">MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles.</a> Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+extracellular+vesicles+induce+vasoconstriction+and+reduce+cerebral+blood+flow+in+mice.">Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice.</a> Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).</li><li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+microvesicles+levels+and+effects+of+associated+factors+in+elderly+patients+with+obstructive+sleep+apnea.">Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).</li><li>Kubo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+lung+disease.">Extracellular vesicles in lung disease.</a> Chest. 153 (1), 210-216 (2018).</li><li>Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preeclampsia+and+Extracellular+Vesicles.">Preeclampsia and Extracellular Vesicles.</a> Current Hypertension Reports. 18 (9), 68 (2016).</li><li>Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+exosomes+in+the+therapy+of+the+cartilage+and+bone+complications;+emphasis+on+osteoarthritis.">The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis.</a> Life Science. 236, 116861 (2019).</li><li>Shi, J., Gilbert, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactadherin+inhibits+enzyme+complexes+of+blood+coagulation+by+competing+for+phospholipid-binding+sites.">Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites.</a> Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).</li><li>Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+endothelial+locus-1+(Del-1)+mediates+clearance+of+platelet+microparticles+by+the+endothelium.">Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium.</a> Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).</li><li>Frey, B., Gaipl, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+functions+of+phosphatidylserine+in+membranes+of+dying+cells+and+microvesicles.">The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles.</a> Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).</li><li>Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+removal+by+single-step+centrifugation.">Platelet removal by single-step centrifugation.</a> Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+placenta-derived+extracellular+vesicles+with+pre-eclampsia+and+associated+hypercoagulability:+a+clinical+observational+study.">Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study.</a> BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+applications+of+microparticles+in+the+diagnosis,+treatment,+and+prognosis+of+lung+cancer.">The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).</li><li>Piwkham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+red+blood+cell+microvesiculation+exerts+procoagulant+activity+of+blood+cell+storage+in+Southeast+Asian+ovalocytosis.">The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis.</a> Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).</li><li>Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+clot+based+assay+for+detection+of+procoagulant+cell-derived+microparticles.">A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).</li></ol>

כל המחברים הצהירו כי אין ניגודי עניינים פוטנציאליים.

במחקר זה תוארה הכנת פלזמה עשירה ב-EV, ורציונליות השיטה אומתה באמצעות ציטומטריית זרימה. לאחר מכן, דגימות הפלזמה המסוידות נותחו במשך זמן ACT באמצעות מנתח קריש המבוסס על עקרונות צמיגות24. כפי שניתן לראות באיור 3A, נמצא כי ריכוז כלי הרכב החשמליים המתקבלים באמצעות אולט?...

פקקת, הנגרמת על ידי קרישיות יתר, ממלאת תפקיד משמעותי במחלות שונות, כולל טראומה מוחית1, רעלת הריון2, גידולים3 וחולי שבר4. המנגנון העומד בבסיס קרישיות יתר הוא מורכב, ולאחרונה הושם דגש על תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV) בהפרעות קרישה. כלי רכב חשמליים הם גופים דמויי שלפוחית בעלי מבנה דו-שכבתי המתנתקים מקרום התא, בקוטר שבין 10 ננומטר ל-1000 ננומטר. הם קשורים למגוון תהליכי מחלה, במיוחד הפרעות קרישה5. מספר מחקרים זיהו רכבים חשמליים כמנבא מבטיח לסיכון לפקקת 6,7. פעילות הקרישה של כלי רכב חשמליים תלויה בביטוי של גורמי קרישה, בעיקר גורם רקמה (TF) ופוספטידיל-סרין (PS). כלי רכב חשמליים בעלי פעילות פרוקוגנטית חזקה משפרים באופן משמעותי את היעילות הקטליטית של טנאז וקומפלקס פרותרומבין, ובכך מקדמים פיברינוגן בתיווך טרומבין ופקקת מקומית8. רמות גבוהות של כלי רכב חשמליים והקשר הסיבתי שלהם עם קרישיות יתר נצפו במחלות רבות9. לפיכך, סטנדרטיזציה של זיהוי כלי רכב חשמליים ודיווח על פעילותם המונעת קרישה היא תחום חשוב בחקירה10.
נכון להיום, רק ערכות מסחריות מעטות זמינות לאיתור פעילות הקרישה של כלי רכב חשמליים. בדיקת MP-Activity ובדיקת MP-TF, המיוצרת על ידי חברה מסחרית, הן בדיקות פונקציונליות המשמשות למדידת פעילות הקרישה של EV בפלזמה11. בדיקות אלה משתמשות בעיקרון דומה לזה של בדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים כדי לזהות PS ו- TF על כלי רכב חשמליים. עם זאת, ערכות אלה יקרות ומוגבלות למספר מוסדות מחקר ברמה גבוהה. התהליך מורכב וגוזל זמן, ולכן קשה ליישם אותם במסגרות קליניות. בנוסף, בדיקת פוספוליפיד מקרישה (PPL) שפותחה באופן מסחרי מערבבת פלזמה נטולת PS עם פלסמת בדיקה, ומודדת את זמן הקרישה כדי לזהות כמותית רמות של PS-positive EVs12. עם זאת, בדיקות אלה מתמקדות בעיקר ב-PS וב-TF על כלי רכב חשמליים, תוך התעלמות ממסלולי קרישה אחרים שבהם כלי רכב חשמליים עשויים להיות מעורביםב-12.
מערכת קרישת הפלזמה מורכבת וכוללת רכיבים "בלתי נראים" ו"נראים", כולל חומרי קרישה, נוגדי קרישה, מערכות פיברינוליטיות ורכבים חשמליים המרחפים בפלזמה. מבחינה פיזיולוגית, רכיבים אלה שומרים על איזון דינמי. במצבים פתולוגיים, עלייה משמעותית במחזור הדם של כלי רכב חשמליים תורמת לקרישיות יתר, במיוחד בחולים עם טראומה מוחית, רעלת הריון, שברים וסוגים שונים של סרטן13. כיום, הערכת מצב הקרישה במעבדות קליניות כוללת בעיקר הערכת מערכת הקרישה, מערכת נוגדי הקרישה ופיברינוליזה 14,15,16,17. זמן פרותרומבין, זמן תרומבופלסטין חלקי פעיל, זמן תרומבין ויחס מנורמל בינלאומי משמשים בדרך כלל להערכת רמות פקטורי הקרישה במערכת הקרישה18. עם זאת, מחקרים אחרונים גילו כי בדיקות אלה אינן משקפות באופן מלא את קרישיות יתר של מחלות מסוימות19. שיטות בדיקה אחרות, כגון טרומבואלסטומטריה (TEG), TEG סיבובי וניתוח סונוקרוט מודדות שינויים ויסקו-אלסטיים בדם מלא20,21. מכיוון שדגימות דם שלמות מכילות תאי דם וטסיות דם רבים, בדיקות אלה נוטות יותר להצביע על מצב הקרישה של הדגימה בכללותה. כמה חוקרים דיווחו על תפקידם של תאי דם וטסיות בפעילות קרישה22,23. מחקר שנערך לאחרונה גילה גם כי בדיקות קודמות של תפקודי קרישה נתקלות בקשיים באיתור שינויים בפעילות הקרישה של מיקרו-חלקיקים24. לכן, הוצעה השערה כי ניתן להעריך את פונקציית הקרישה של כלי רכב חשמליים על ידי מדידות ויסקו-אלסטיות של זמן הקרישה הפעיל (ACT) בפלזמה עשירה ב-EV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles</td>
			<td>3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>For quantitative detection of MP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Werfen (china)</td>
			<td>0020006800</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Century Clot analyzer</td>
			<td>Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td>The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable probe and test cup</td>
			<td>Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR Fortessa flow cytometer</td>
			<td>BD, USA</td>
			<td></td>
			<td>Used to detect MP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megamix polystyrene beads</td>
			<td>Biocytex, Marseille, France</td>
			<td>7801</td>
			<td>The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 &#181;m, 0.9 &#181;m and 3 &#181;m.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the procoagulant activity of extracellular vesicle (ev) using ev-activated clotting time (ev-act)

תפקידן של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV) במחלות שונות זוכה לתשומת לב מוגברת, במיוחד בשל פעילותן החזקה כחומר קרישה. עם זאת, יש צורך דחוף בבדיקה ליד המיטה כדי להעריך את פעילות הקרישה של EV במסגרות קליניות. מחקר זה מציע להשתמש בזמן הפעלת תרומבין של פלזמה עשירה ברכב חשמלי כמדד לפעילות הקרישה של EV. נהלים סטנדרטיים ננקטו כדי להשיג דם שלם נתרן ציטרלי, ואחריו צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לקבל פלזמה עשירה EV. הפלזמה העשירה ברכב חשמלי וסידן כלורי נוספו לכוס הבדיקה, והשינויים בצמיגות נוטרו בזמן אמת באמצעות אנלייזר. זמן הקרישה הטבעי של פלזמה עשירה ב-EV, המכונה EV-ACT, נקבע. התוצאות הראו עלייה משמעותית ב-EV-ACT כאשר EV הוסר מפלזמה שהתקבלה ממתנדבים בריאים, בעוד שהיא ירדה משמעותית כאשר EV הועשר. יתר על כן, EV-ACT קוצר במידה ניכרת בדגימות אנושיות מרעלת הריון, שבר בירך וסרטן ריאות, מה שמצביע על רמות גבוהות של EV פלזמה וקידום קרישת יתר בדם. עם ההליך הפשוט והמהיר שלו, EV-ACT מראה הבטחה כמבחן ליד המיטה להערכת תפקוד הקרישה בחולים עם רמות גבוהות של EV בפלזמה.

Thrombosis, which is caused by hypercoagulability, plays a significant role in various diseases, including brain trauma1, pre-eclampsia2, tumors3, and fracture patients4. The mechanism underlying hypercoagulability is complex, and recent emphasis has been placed on the role of extracellular vesicles (EV) in coagulation disorders. EVs are vesicle-like bodies with a bilayer structure that detach from the cell membrane, ranging in diameter from 10 nm to 1000 nm. They are associated with a variety of disease processes, particularly coagulation disorders5. Several studies have identified EVs as a promising predictor of thrombosis risk6,7. The procoagulant activity of EVs depends on the expression of coagulation factors, primarily tissue factor (TF) and phosphatidylserine (PS). EVs with robust procoagulant activity significantly enhance the catalytic efficiency of tenase and prothrombin complex, thereby promoting thrombin-mediated fibrinogen and local thrombosis8. Elevated levels of EVs and their causal relationship with hypercoagulability have been observed in numerous diseases9. Consequently, standardizing the detection of EVs and reporting their procoagulant activity is an important area of investigation10.
To date, only a few commercial kits are available for detecting the procoagulant activity of EVs. The MP-Activity assay and the MP-TF assay, produced by a commercial company, are functional assays used to measure EV&#39;s procoagulant activity in plasma11. These assays employ a principle similar to that of enzyme-linked immunosorbent assays to detect PS and TF on EVs. However, these kits are expensive and limited to a few high-level research institutions. The process is complex and time-consuming, making it challenging to implement them in clinical settings. Additionally, a commercially developed procoagulant phospholipid (PPL) assay mixes PS-free plasma with test plasma, measuring clotting time to quantitatively detect levels of PS-positive EVs12. However, these assays primarily focus on PS and TF on EVs, overlooking other clotting pathways that circulating EVs may be involved in12.
The plasma coagulation system is intricate and comprises both &#34;invisible&#34; and &#34;visible&#34; components, including coagulants, anticoagulants, fibrinolytic systems, and EVs suspended in the plasma. Physiologically, these components maintain a dynamic balance. In pathological conditions, significantly increased EVs in circulation contribute to hypercoagulability, particularly in patients with brain trauma, preeclampsia, fractures, and various types of cancer13. Currently, the evaluation of coagulation status in clinical laboratories primarily involves assessing the coagulation system, anticoagulation system, and fibrinolysis14,15,16,17. Prothrombin time, activated partial thromboplastin time, thrombin time, and international normalized ratio are commonly used to evaluate coagulation factor levels in the coagulation system18. However, recent studies have revealed that these tests do not fully reflect the hypercoagulability of certain diseases19. Other assay methods, such as thromboelastometry (TEG), rotational TEG, and Sonoclot analysis, measure whole-blood viscoelastic changes20,21. Since whole blood samples contain numerous blood cells and platelets, these tests are more likely to indicate the clotting status of the sample as a whole. Some researchers have reported on the role of blood cells and platelets in procoagulant activity22,23. A recent study also discovered that previous coagulation function tests face difficulties in detecting changes in microparticles&#39; procoagulant activity24. Therefore, a hypothesis has been proposed that the procoagulant function of EVs can be evaluated by viscoelastic measurements of the activated clotting time (ACT) in EV-rich plasma.

מחבר זרקור: פענוח הפרעות קרישה בנפגעי מוח טראומטיים 

קביעת פעילות הקרישה של שלפוחית חוץ-תאית (EV) באמצעות זמן קרישה המופעל על ידי EV (EV-ACT)

Our primary focus is on coagulation disorders in patients who have suffered brain trauma. In this study, we try to monitor changes in the clotting function with extracellular vesical activity clotting time. Our teams put attention on the research of brain injury.And in the brain injury, they are a severe condition we call the hyper coagulated state. It's very difficult to measure. And we find in the blood of patient there are some micro vesicle we called extracellular vesicles, including the apoptosis body, micro vesicle, and exosome.And they are different in the pro coagulated ability. So we must find a method to measure the ability. And this method, we can acute quickly to find the difference of the extracellular vesicles.That's very important. Depend on this measure, we can do many things. We have make sure it in the TPI mice, and the clinical patient, especially in the peripheral circulation, it will cost some embolization.That is very, very serious in the clinical. Our protocol offered a significant advantage compared to other techniques due to its simplicity, cost effectiveness, and speed. It allows for a blood clotting test to be conducted at the bedside, eliminating the need for extensive laboratory processing.Our research have established a new method that can measure the hyper coagulated states of the peripheral blood. It can be used not only in the TPI, we can also used in other disease such as sepsis, pre-eclampsia, tumor, and hematology disease. In the future, we have planned to investigated the of in scanning for clinical hyper a condition that increases the risk of blood clot.

זמן הפעלת הטרומבין של פלזמה עשירה ברכב חשמלי נמדד באמצעות מנתח שיטה ויסקו-אלסטית למדידת זמן קרישת פלזמה. המכונה מורכבת מארבעה רכיבים עיקריים: ממיר אותות אלקטרוניים, גשוש, מיכל גילוי וגוף חימום (איור 1A,B). הגשושית משתמשת בתנודות בתדירות גבוהה ומשרעת נמוכה כדי לזהות ...

Watch this Scientific Journal Video about Deciphering Coagulation Disorders in Traumatic Brain Injury Patients at JoVE.com

פרוטוקול זה חוקר את השימוש בפלזמה עשירה בשלפוחית חוץ-תאית (EV) כאינדיקטור ליכולת הקרישה של EV. פלזמה עשירה ב- EV מתקבלת באמצעות תהליך של צנטריפוגה דיפרנציאלית והסתיידות לאחר מכן.

The role of extracellular vesicles (EV) in various diseases is gaining increased attention, particularly due to their potent procoagulant activity. ...

ההתמקדות העיקרית שלנו היא בהפרעות קרישה בחולים שסבלו מטראומה מוחית. במחקר זה אנו מנסים לעקוב אחר שינויים בתפקוד הקרישה עם זמן קרישת פעילות שלפוחית חוץ-תאית. הצוותים שלנו מקדישים תשומת לב לחקר פגיעות מוחיות.ובפגיעה המוחית, הם מצב חמור שאנו מכנים מצב היפר קרוש. קשה מאוד למדוד. ואנו מוצאים שבדם של מטופלים יש כמה שלפוחיות מיקרו שקראנו להן שלפוחיות חוץ-תאיות, כולל גוף אפופטוזיס, שלפוחית מיקרו ואקסוזום.והם שונים ביכולת הקרישה המקצועית. לכן עלינו למצוא שיטה למדוד את היכולת. ושיטה זו, אנו יכולים חריף במהירות כדי למצוא את ההבדל של שלפוחיות חוץ-תאיות.זה חשוב מאוד. תלוי במדד הזה, אנחנו יכולים לעשות הרבה דברים. וידאנו את זה בעכברי TPI, ובחולה הקליני, במיוחד במחזור הדם ההיקפי, זה יעלה קצת אמבוליזציה.זה מאוד מאוד חמור מבחינה קלינית. הפרוטוקול שלנו הציע יתרון משמעותי בהשוואה לטכניקות אחרות בשל פשטותו, עלות-תועלתו ומהירותו. הוא מאפשר לבצע בדיקת קרישת דם ליד המיטה, ומבטל את הצורך בעיבוד מעבדה נרחב.המחקר שלנו ביסס שיטה חדשה שיכולה למדוד את מצבי הקרישה ההיפר של הדם ההיקפי. זה יכול לשמש לא רק TPI, אנחנו יכולים גם להשתמש במחלות אחרות כגון אלח דם, רעלת הריון, גידול, ומחלה המטולוגית. בעתיד, תכננו לחקור את ה- OF בסריקה להיפר קליני מצב המגדיל את הסיכון לקריש דם.

determination-procoagulant-activity-extracellular-vesicle-ev-using-ev

Research

JoVE Journal

Medicine

Determination of the Procoagulant Activity of Extracellular Vesicle (EV) Using EV-Activated Clotting Time (EV-ACT)

548 Views.  Tianjin Medical University General Hospital. ההתמקדות העיקרית שלנו היא בהפרעות קרישה בחולים שסבלו מטראומה מוחית. במחקר זה אנו מנסים לעקוב אחר שינויים בתפקוד הקרישה עם זמן קרישת פעילות שלפוחית חוץ-תאית. הצוותים שלנו מקדישים תשומת לב לחקר פגיעות מוחיות.ובפגיעה המוחית, הם מצב חמור שאנו מכנים מצב היפר קרוש. קשה מאוד ל...

Video: מחבר זרקור: פענוח הפרעות קרישה בנפגעי מוח טראומטיים 

The role of extracellular vesicles (EV) in various diseases is gaining increased attention, particularly due to their potent procoagulant activity. However, there is an urgent need for a bedside test to assess the procoagulant activity of EV in clinical settings. This study proposes the use of thrombin activation time of EV-rich plasma as a measure of EV's procoagulant activity. Standardized procedures were employed to obtain sodium-citrated whole blood, followed by differential centrifugation to obtain EV-rich plasma. The EV-rich plasma and calcium chloride were added to the test cup, and the changes in viscoelasticity were monitored in real-time using an analyzer. The natural coagulation time of EV-rich plasma, referred to as EV-ACT, was determined. The results revealed a significant increase in EV-ACT when EV was removed from plasma obtained from healthy volunteers, while it significantly decreased when EV was enriched. Furthermore, EV-ACT was considerably shortened in human samples from preeclampsia, hip fracture, and lung cancer, indicating elevated levels of plasma EV and promotion of blood hypercoagulation. With its simple and rapid procedure, EV-ACT shows promise as a bedside test for evaluating coagulation function in patients with high plasma EV levels.

This protocol investigates the use of extracellular vesicle (EV)-rich plasma as an indicator of the coagulative ability of EV. EV-rich plasma is obtained through a process of differential centrifugation and subsequent recalcification.

Isolation of Extracellular Vesicle (EV)-Rich Plasma from Human Blood and Detection of Activated Clotting Time 

To begin, centrifuge the human blood at 120 G for 20 minutes at room temperature to remove the blood cells. Then transfer the upper half of the supernatant to a new tube. Next, centrifuge the platelet rich plasma to remove the platelets, and transfer the upper half of the supernatant to a new tube.Then remove the cell debris by centrifuging the platelet to our plasma at 13, 000 G for two minutes. Transfer the upper half of the supernatant to a new tube. Turn on the clot analyzer to detect extracellular vesicle, or EV activated clotting time, and preheat the instrument to 37 degrees Celsius.Install the disposable probe and test cup. Then start the quality control procedure of the machine. After the quality control run, enter sample information into the system.Then add 200 microliters of EV-rich plasma to the test cup, followed by 20 millimolar, 170 microliters of calcium chloride. Click the start button, close the cover, and allow the probe to detect the change in sample resistance. The unqualified EV samples exhibit a distinct cluster with a slightly larger particle size near the gate of EV.In contrast, qualified EV-rich samples showed most signals within the gate of EV as a single group.An increase in EV concentration shortened EV activated clotting time, while a decrease in EV concentration prolonged EV activated clotting time. EV-rich plasma samples from patients with preeclampsia, hip fractures, and lung cancer had significantly shorter EV activated clotting time compared to healthy volunteers.