עבודה זו נתמכה על ידי NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) ופרופסורת ג'ון סי פארקר (N.M). ברצוננו להודות לגב' סיירה ארצ'יבלד על הערותיה המועילות

המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל (פרוטוקול מספר: 14-2108).
1. איסוף דם מתורמים
<ol><li>לאסוף דם שלם באמצעות venipuncture נקי לתוך הווריד antecubital עם מחט 21 גרם. השליכו את 3 מ"ל הדם הראשונים מכיוון שחלק זה של הדם עשוי להכיל TF מתאים פריווסקולריים.</li>
	<li>יש לשאוב 2.7 או 1.8 מ"ל (בהתאם לגודל הצינורות) של דם לתוך vacutainer המכיל 3.2% נתרן ציטראט (0.109 mol/L). אין למלא את הצינורות. הפוך בעדינות צינורות מיד לאחר איסוף הדם כדי לפזר את ציטראט נתרן.</li>
	<li>הימנע תסיסה אם הצינורות מועברים לפני העיבוד. הכן פלזמה בתוך 2 שעות של איסוף הדם.</li>
</ol>2. הכנת פלזמה שליטה שלילית
הערה: אין להניח דגימות על קרח בכל עת לפני ההקפאה הסופית.
<ol><li>הכינו פלסמת בקרה שלילית באמצעות דם מלא ממתנדבים בריאים. מיד לאחר איסוף הדם, להכין פלזמה ללא טסיות כדלקמן.<ol><li>העברת דגימות דם מצינורות vacutainer לצינורות 15 מ"ל.</li>
		<li>דגימות דם צנטריפוגות ב-2,500 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (20-24 מעלות צלזיוס) ללא בלימה.</li>
		<li>מעבירים את הסופרנאטנט (פלזמה ענייה בטסיות) לצינור חדש וחוזרים על הספין באותם תנאים.</li>
		<li>מעבירים את הסופרנאטנט (פלזמה מדולדלת טסיות) לצינור חדש.</li>
		<li>Aliquot את הדגימה לתוך ≥100 μL aliquots. השאירו כ-100 μL בתחתית הצינור.</li>
		<li>הקפיאו מיד את הפלזמה המדולדלת מטסיות הדם בטמפרטורה של -80°C (איור 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת פלזמה שליטה חיובית
הערה: התגובה לליפופוליסכריד משתנה בין אנשים.
<ol><li>העברת דגימות דם מן vacutainers ל 15 מ"ל צינורות.</li>
	<li>הכן פלזמה בקרה חיובית באמצעות דם מלא ממתנדבים בריאים מגורה עם lipopolysaccharide (LPS) מ Escherichia coli O111: B4 (10 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 5 שעות ב 37 ° C עם תסיסה.</li>
	<li>לאחר 5 שעות דגירה, בצע את השלבים 2.1.2 עד 2.1.6.</li>
</ol>4. בידוד שלפוחיות חוץ תאיות מפלזמה
הערה: ייתכן שכדורי EV לא יהיו גלויים. זמן ההפשרה תלוי בנפח הדגימה, אך בדרך כלל אנו מפשירים פלזמה של 100 μL למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
<ol><li>הפשיר דגימות פלזמה ב 37 ° C.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של HBSA ללא סידן [HBSA-Ca(-)] חיץ [137 mM NaCl, 5.38 mM KCl, 5.55 mM גלוקוז, 10 mM HEPES, 0.1% (w/v) אלבומין בסרום בקר] לכל 100 μL של דגימת פלזמה בצינור 1.5 מ"ל.</li>
	<li>דגימות פלזמה צנטריפוגות ב 20,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.</li>
	<li>הרכיבו מחדש את כדורית ה-EV על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ HBSA-Ca(-) לכל צינור, פיפטה למעלה ולמטה במיקום של כדורית ה-EV, וערבול כל צינור לפני צנטריפוגה בפעם השנייה ב-20,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4°C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.</li>
	<li>הרכיבו מחדש את כדורית ה-EV ב-80 מיקרוליטר של HBSA-Ca(-) ופיפטה למעלה ולמטה במיקום של גלולת ה-EV (איור 2).</li>
</ol>5. אופציה: בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה
<ol><li>לאחר שלב 4.3, אספו את הסופרנאטנט והאולטרה-צנטריפוגה ב-100,000 × גרם למשך 70 דקות ב-4°C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.</li>
	<li>הרכיבו מחדש את גלולת ה-EV על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ HBSA-Ca(-) לכל צינור ומערבולת כל צינור לפני אולטרה-צנטריפוגה בפעם השנייה ב-100,000 × גרם למשך 70 דקות ב-4°C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנאטנט עד 20 מיקרוליטר מבלי להפריע לכדורית ה-EV.</li>
	<li>הרכיבו מחדש את גלולת ה-EV ב-80 מיקרוליטר של HBSA-Ca(-).</li>
</ol>6. מדידת פעילות גורם רקמת השלפוחית החוץ תאית
הערה: דגימות EV צריך להיות pipeted ולערבל היטב כדי לערבב לפני הוספה לבארות. EDTA-דיסודיום יעכב את היכולת של FXa לבקע את המצע הכרומוגני. לכן, לא ניתן להשתמש ב-EDTA-דיסודיום כתחליף ל-EDTA-tetrasodium בשלב 6.7.
<ol><li>הוסף 40 μL של דגימת EV לשתי בארות של צלחת 96 בארות.</li>
	<li>הוסף 11 μL של עכבר מעכב TF IgG אנטי אנושי [(36.4 מיקרוגרם / מ"ל, ריכוז סופי 7.8 מיקרוגרם / מ"ל)] לבאר אחת של דגימת EV ו 11 μL של עכבר בקרה IgG [(36.4 מיקרוגרם / מ"ל, ריכוז סופי 7.8 מיקרוגרם / מ"ל)] לבאר השנייה.</li>
	<li>דוגרים על צלחת 96 בארות במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>במהלך זמן הדגירה, הכינו 50 μL/well של תקני TF (0, 0.32, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10 ו-20 pg/mL) בשכפול באמצעות TF רקומביננטי משומן.</li>
	<li>יש להכין את תערובת הגורמים על-ידי ערבוב של 4 מ"ל HBSA עם סידן [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl2, ריכוז סופי 10 mM], 800 μL של 900 nM FX ב-HBSA-Ca(+) (ריכוז סופי: 146.4 nM) ו-120 μL של 200 nM FVIIa ב-HBSA-CA(+) (ריכוז סופי: 4.8 nM).</li>
	<li>מוסיפים 50 μL של תמיסת תערובת הגורמים לכל באר, מכסים את הצלחת בסרט ודגרים במשך שעתיים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר שעתיים, יש להפסיק את ייצור FXa על ידי הוספת 25 μL של חוצץ HBSA ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tetrasodium, ריכוז סופי 5 mM] ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הרכיבו מחדש את המצע הכרומוגן שנבקע על ידי FXa ל-4mM (הוסיפו 8.7 מ"ל מים מזוקקים לבקבוקון של 25 מ"ג).</li>
	<li>הוסף 25 μL של תמיסת המצע הכרומוגנית לכל באר, כסה את הצלחת בסרט ולאחר מכן ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור, ודגר במשך 15 דקות ב 37 ° C.</li>
	<li>לאחר 15 דקות של דגירה, להסיר בועות עם מחט או על ידי צנטריפוגה ב 1,500 × גרם במשך 1 דקות.</li>
	<li>קרא את הצלחת במהירות של 405 ננומטר באמצעות קורא צלחות עם תערובת אחת לפני הקריאה.</li>
	<li>המר את דור FXa של כל באר לפעילות TF באמצעות העקומה הסטנדרטית הנוצרת באמצעות TF רקומביננטי משומן.</li>
	<li>חישוב יצירת FXa תלוי TF (פעילות EVTF) באמצעות משוואה (1): דור FXa תלוי TF (פעילות EVTF [pg/mL]) = יצירת FXa כוללת (שליטה ב-IgG היטב) - דור FXa עצמאי TF (באר IgG נגד TF) (איור 3) (1)</li>
</ol>

רגישות משופרת לבדיקת פעילות פקטור רקמה בשלפוחיות חוץ-תאיות

<ol>
	<li>Grover, S. P., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor:+an+essential+mediator+of+hemostasis+and+trigger+of+thrombosis.">Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).</li><li>Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+local+phospholipid+environment+modulates+the+activation+of+blood+clotting.">The local phospholipid environment modulates the activation of blood clotting.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6556-6563 (2007).</li><li>Tavoosi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+phospholipid+synergy+in+blood+clotting.">Molecular determinants of phospholipid synergy in blood clotting.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23247-23253 (2011).</li><li>Wang, J., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelin+encrypts+tissue+factor:+ATP-induced+activation+of+A-SMase+leads+to+tissue+factor+decryption+and+microvesicle+shedding.">Sphingomyelin encrypts tissue factor: ATP-induced activation of A-SMase leads to tissue factor decryption and microvesicle shedding.</a> Blood Advances. 1 (13), 849-862 (2017).</li><li>Kornhuber, J., Rhein, C., Muller, C. P., Muhle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+sphingomyelinase+in+health+and+disease.">Secretory sphingomyelinase in health and disease.</a> Biological Chemistry. 396 (6-7), 707-736 (2015).</li><li>Versteeg, H. H., Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+coagulant+function+is+enhanced+by+protein-disulfide+isomerase+independent+of+oxidoreductase+activity.">Tissue factor coagulant function is enhanced by protein-disulfide isomerase independent of oxidoreductase activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (35), 25416-25424 (2007).</li><li>Reinhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+disulfide+isomerase+acts+as+an+injury+response+signal+that+enhances+fibrin+generation+via+tissue+factor+activation.">Protein disulfide isomerase acts as an injury response signal that enhances fibrin generation via tissue factor activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (3), 1110-1122 (2008).</li><li>Langer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+activation+of+monocyte+tissue+factor+by+antithymocyte+globulin+is+dependent+on+complement+and+protein+disulfide+isomerase.">Rapid activation of monocyte tissue factor by antithymocyte globulin is dependent on complement and protein disulfide isomerase.</a> Blood. 121 (12), 2324-2335 (2013).</li><li>Bogdanov, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+spliced+human+tissue+factor:+a+circulating,+soluble,+thrombogenic+protein.">Alternatively spliced human tissue factor: a circulating, soluble, thrombogenic protein.</a> Nature Medicine. 9 (4), 458-462 (2003).</li><li>Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+spliced+tissue+factor+-+one+cut+too+many.">Alternatively spliced tissue factor - one cut too many.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 5-8 (2007).</li><li>Censarek, P., Bobbe, A., Grandoch, M., Schror, K., Weber, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+spliced+human+tissue+factor+(asHTF)+is+not+pro-coagulant.">Alternatively spliced human tissue factor (asHTF) is not pro-coagulant.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 11-14 (2007).</li><li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Osterud, B., Bjorklid, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+in+blood+cells+and+endothelial+cells.">Tissue factor in blood cells and endothelial cells.</a> Frontiers in Bioscience (Elite Edition). 4 (1), 289-299 (2012).</li><li>Hisada, Y., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-derived+tissue+factor-positive+extracellular+vesicles:+biomarkers+of+thrombosis+and+survival.">Cancer cell-derived tissue factor-positive extracellular vesicles: biomarkers of thrombosis and survival.</a> Current Opinion in Hematology. 26 (5), 349-356 (2019).</li><li>Vatsyayan, R., Kothari, H., Pendurthi, U. R., Rao, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Hydroxy-2-nonenal+enhances+tissue+factor+activity+in+human+monocytic+cells+via+p38+mitogen-activated+protein+kinase+activation-dependent+phosphatidylserine+exposure.">4-Hydroxy-2-nonenal enhances tissue factor activity in human monocytic cells via p38 mitogen-activated protein kinase activation-dependent phosphatidylserine exposure.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (7), 1601-1611 (2013).</li><li>Mackman, N., Sachetto, A. T. A., Hisada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+tissue+factor-positive+extracellular+vesicles+in+plasma:+strengths+and+weaknesses+of+current+methods.">Measurement of tissue factor-positive extracellular vesicles in plasma: strengths and weaknesses of current methods.</a> Current Opinion in Hematology. 29 (5), 266-274 (2022).</li><li>Lee, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-analytical+and+analytical+variables+affecting+the+measurement+of+plasma-derived+microparticle+tissue+factor+activity.">Pre-analytical and analytical variables affecting the measurement of plasma-derived microparticle tissue factor activity.</a> Thrombosis Research. 129 (1), 80-85 (2012).</li><li>Claussen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicle-associated+tissue+factor+procoagulant+activity+for+the+preoperative+diagnosis+of+ovarian+cancer.">Microvesicle-associated tissue factor procoagulant activity for the preoperative diagnosis of ovarian cancer.</a> Thrombosis Research. 141, 39-48 (2016).</li><li>Mackman, N., Hisada, Y., Archibald, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+and+its+procoagulant+activity+on+cancer-associated+thromboembolism+in+pancreatic+cancer:+Comment+by+Mackman+et+al.">Tissue factor and its procoagulant activity on cancer-associated thromboembolism in pancreatic cancer: Comment by Mackman et al.</a> Cancer Science. 113 (5), 1885-1887 (2022).</li><li>Sachetto, A. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+four+commercial+ELISAs+to+measure+tissue+factor+in+human+plasma.">Evaluation of four commercial ELISAs to measure tissue factor in human plasma.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100133 (2023).</li><li>Archibald, S. J., Hisada, Y., Bae-Jump, V. L., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+bead-based+assay+to+measure+levels+of+human+tissue+factor+antigen+in+extracellular+vesicles+in+plasma.">Evaluation of a new bead-based assay to measure levels of human tissue factor antigen in extracellular vesicles in plasma.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 6 (2), e12677 (2022).</li><li>Tatsumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+new+commercial+assay+to+measure+microparticle+tissue+factor+activity+in+plasma:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Evaluation of a new commercial assay to measure microparticle tissue factor activity in plasma: communication from the SSC of the ISTH.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (11), 1932-1934 (2014).</li><li>Hisada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+microparticle+tissue+factor+activity+in+clinical+samples:+A+summary+of+two+tissue+factor-dependent+FXa+generation+assays.">Measurement of microparticle tissue factor activity in clinical samples: A summary of two tissue factor-dependent FXa generation assays.</a> Thrombosis Research. 139, 90-97 (2016).</li><li>Tatsumi, K., Hisada, Y., Connolly, A. F., Buranda, T., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients+with+severe+orthohantavirus+cardiopulmonary+syndrome+due+to+Sin+Nombre+Virus+infection+have+increased+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+and+an+activated+coagulation+system.">Patients with severe orthohantavirus cardiopulmonary syndrome due to Sin Nombre Virus infection have increased circulating extracellular vesicle tissue factor and an activated coagulation system.</a> Thrombosis Research. 179, 31-33 (2019).</li><li>Schmedes, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Extracellular+Vesicle+Tissue+Factor+Activity+During+Orthohantavirus+Infection+Is+Associated+With+Intravascular+Coagulation.">Circulating Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity During Orthohantavirus Infection Is Associated With Intravascular Coagulation.</a> Journal of Infectious Diseases. 222 (8), 1392-1399 (2020).</li><li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-Brief+report.">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-Brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li><li>Campbell, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+coagulopathies+associated+with+COVID-19+and+sepsis.">Comparison of the coagulopathies associated with COVID-19 and sepsis.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), e12525 (2021).</li><li>Guervilly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+extreme+levels+of+extracellular+vesicles:+tissue+factor+activity+in+patients+with+severe+COVID-19.">Dissemination of extreme levels of extracellular vesicles: tissue factor activity in patients with severe COVID-19.</a> Blood Advances. 5 (3), 628-634 (2021).</li><li>Hisada, Y., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+tissue+factor+activity+in+extracellular+vesicles+from+human+plasma+samples.">Measurement of tissue factor activity in extracellular vesicles from human plasma samples.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 3 (1), 44-48 (2019).</li><li>Sachetto, A. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+activity+of+small+and+large+extracellular+vesicles+in+different+diseases.">Tissue factor activity of small and large extracellular vesicles in different diseases.</a> Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis. 7 (3), 100124 (2023).</li><li>Bom, V. J., Bertina, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+Ca2+,+phospholipids+and+tissue-factor+apoprotein+to+the+activation+of+human+blood-coagulation+factor+X+by+activated+factor+VII.">The contributions of Ca2+, phospholipids and tissue-factor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII.</a> Biochemical Journal. 265 (2), 327-336 (1990).</li><li>Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor+activity+is+increased+in+a+combined+platelet+and+microparticle+sample+from+cancer+patients.">Tissue factor activity is increased in a combined platelet and microparticle sample from cancer patients.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 604-609 (2008).</li><li>Gurung, S., Perocheau, D., Touramanidou, L., Baruteau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+exosome+journey:+from+biogenesis+to+uptake+and+intracellular+signalling.">The exosome journey: from biogenesis to uptake and intracellular signalling.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 47 (2021).</li><li>Garnier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+induced+to+express+mesenchymal+phenotype+release+exosome-like+extracellular+vesicles+carrying+tissue+factor.">Cancer cells induced to express mesenchymal phenotype release exosome-like extracellular vesicles carrying tissue factor.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (52), 43565-43572 (2012).</li><li>Park, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+factor-bearing+exosome+secretion+from+human+mechanically+stimulated+bronchial+epithelial+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Tissue factor-bearing exosome secretion from human mechanically stimulated bronchial epithelial cells in vitro and in vivo.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (6), 1375-1383 (2012).</li></ol>

אין אינטרסים מתחרים לחשוף.

כאן מוצג הפרוטוקול של בדיקת פעילות ה- EVTF הפנימית שלנו. ישנם שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול. בעת בנייה מחדש של כדורית EV, חשוב לבצע פיפטה למעלה ולמטה במיקום של גלולת EV גם אם היא אינה נראית לעין. הרכבה מחדש חלקית של כדורית EV תגרום להערכה שלילית שגויה או הערכת חסר של ערכי פעילות EVTF של הדגימות. שני?...

קרישת הדם מתחילה עם קשירה של גורם (F) VII/VIIa לגורם רקמה (TF)1. קומפלקס TF/FVIIa מפעיל הן את FIX והן את FX כדי להפעיל קרישת דם1. ישנן שתי צורות של TF באורך מלא, קשור לקרום: מוצפן ופעיל. בנוסף, קיימת צורה חלופית של TF (asTF). ספינגומיילין ופוספטידילכולין בעלון החיצוני של קרום התא שומרים על TF במצב מוצפן 2,3,4. כאשר תאים מופעלים או ניזוקים, סקרמבלאז פוספוליפידים מעביר פוספטידיל-סרין ופוספוליפידים אחרים בעלי מטען שלילי לעלון החיצוני1. הפעלת התאים גורמת גם לטרנסלוקציה של חומצה sphingomyelinase לעלון החיצוני, שם הוא מפרק sphingomyelin ל ceramide5. שני מנגנונים אלה ממירים TF מוצפן לצורה הפעילה. כמו כן מוצע כי חלבון דיסולפיד איזומראז מתווך היווצרות קשר דיסולפיד בין Cys186 ו- Cys209 ב- TF מוצפן, מה שמביא לביטול הצפנה של TF 6,7,8. asTF קיים גם במחזור הדם אך חסר את תחום הטרנסממברנה ולכן הוא מסיס 9,10. חשוב לציין, ל- asTF יש רמות נמוכות מאוד של פעילות מעודדת קרישה בהשוואה ל- TF פעילבאורך מלא 10,11.
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) משתחררות מתאים מארחים נחים, מופעלים וגוססים, כמו גם מתאי סרטן12. כלי רכב חשמליים מבטאים חלבונים מתאי הוריהם12. EV פעילים נושאי TF משוחררים ממונוציטים פעילים, תאי אנדותל ותאי גידול למחזור הדם 13,14,15. רמות TF בפלזמה ניתנות למדידה על ידי בדיקות מבוססות פעילות ואנטיגן. בדיקות מבוססות אנטיגן כוללות ELISA וציטומטריית זרימה16. ישנן שתי בדיקות שונות מבוססות פעילות: מבחני פעילות TF חד שלבית ודו-שלבי. הבדיקה החד-שלבית מבוססת על בדיקת קרישה מבוססת פלזמה. הדגימה המכילה TF מתווספת לפלזמה והזמן ליצירת קריש נמדד לאחר הסתיידות מחדש. הבדיקה הדו-שלבית מודדת את דור הדגימות של FXa על ידי הוספת FVII או FVIIa, FX וסידן. רמות FXa נקבעות באמצעות מצע שנבקע על ידי FXa.
הן במבחני פעילות TF חד-שלבית והן בשני שלבים, ריכוז ה-TF נקבע באמצעות עקומה סטנדרטית הנוצרת עם TF רקומביננטי. לבדיקות דו-שלביות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר לבדיקה החד-שלבית. מחקרים רבים אישרו כי לבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן 17,18,19,20,21. בנוסף, לבדיקת הפעילות הפנימית שלנו יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר לבדיקת פעילות מסחרית22. לאנשים בריאים יש רמות נמוכות מאוד או בלתי ניתנות לגילוי של פעילות EVTF בפלזמה. לעומת זאת, לאנשים עם מצבים פתולוגיים, כגון סרטן, שחמת, אלח דם וזיהום ויראלי, יש רמות ניתנות לזיהוי של פעילות EVTF וזה קשור לפקקת, קרישה תוך וסקולרית מפושטת, חומרת המחלה, ותמותה 23,24,25,26,27,28. כאן, נתאר את בדיקת הפעילות הדו-שלבית של EVTF.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge</td>
			<td>any company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube for ultracentrifuge</td>
			<td>any company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube</td>
			<td>any company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter</td>
			<td>BD</td>
			<td>367281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>any company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Citrate Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>363083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C69-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 1.5 mL tube</td>
			<td>any company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 15 mL tube</td>
			<td>any company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FVIIa</td>
			<td>Enzyme Research Laboratory</td>
			<td>HFVIIa</td>
			<td>The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FX</td>
			<td>Enzyme Research Laboratory</td>
			<td>HFX1010</td>
			<td>The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>550252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2630</td>
			<td>There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I5381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pefachrome FXa 8595</td>
			<td>Enzyme Research Laboratory</td>
			<td>085-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>any company</td>
			<td>N/A</td>
			<td>We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10873566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima TLX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>TLA-55</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extracellular vesicle tissue factor activity assay

גורם רקמה (TF) הוא קולטן טרנסממברנה עבור פקטור (F) VII ו- FVIIa. קומפלקס TF/FVIIa יוזם את מפל הקרישה על ידי הפעלת FIX ו- FX. TF משתחרר מתאים למחזור הדם בצורה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EV). רמת ה-TF החיובי (+) לרכב חשמלי עולה במחלות שונות, כולל סרטן, זיהומים חיידקיים ונגיפיים ושחמת הכבד, וקשורה לפקקת, קרישה תוך-וסקולרית מפושטת, חומרת מחלות ותמותה. ישנן שתי דרכים למדוד TF+ EV בפלזמה: בדיקות מבוססות אנטיגן ופעילות. הנתונים מצביעים על כך שלבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן. מאמר זה מתאר את בדיקת פעילות ה- EVTF הפנימית שלנו המבוססת על בדיקת דור FXa דו-שלבית. FVIIa, FX וסידן מתווספים לדגימות המכילות TF+ EV כדי ליצור FXa בנוכחות ובהיעדר נוגדן נגד TF כדי להבדיל בין דור FXa תלוי TF לבין דור FXa שאינו תלוי ב- TF. מצע כרומוגני שנבקע על ידי FXa משמש לקביעת רמת FXa, בעוד שעקומה סטנדרטית הנוצרת עם TF רקומביננטי משומן משמשת לקביעת ריכוז TF. לבדיקת פעילות EVTF פנימית זו יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקת פעילות TF מסחרית.

Blood coagulation is initiated with the binding of factor (F) VII/VIIa to tissue factor (TF)1. The TF/FVIIa complex activates both FIX and FX to activate blood coagulation1. There are two forms of full-length, membrane-bound TF: encrypted and active. In addition, there is an alternatively spliced form of TF (asTF). Sphingomyelin and phosphatidylcholine in the outer leaflet of the cell membrane maintain TF in an encrypted state2,3,4. When cells are activated or damaged, phospholipid scramblase transfers phosphatidylserine and other negatively charged phospholipids to the outer leaflet1. The activation of cells also results in the translocation of acid sphingomyelinase to the outer leaflet where it degrades sphingomyelin to ceramide5. These two mechanisms convert encrypted TF to the active form. It is also proposed that protein disulfide isomerase mediates disulfide bond formation between Cys186 and Cys209 in encrypted TF, which results in the de-encryption of TF6,7,8. asTF is also present in the circulation but lacks the transmembrane domain and is therefore soluble9,10. Importantly, asTF has very low levels of procoagulant activity compared to full-length active TF10,11.
Extracellular vesicles (EVs) are released from resting, activated, and dying host cells, as well as cancer cells12. EVs express proteins from their parental cells12. Active TF-bearing EVs are released from activated monocytes, endothelial cells, and tumor cells into the circulation13,14,15. Levels of TF in plasma can be measured by activity- and antigen-based assays. Antigen-based assays include ELISA and flow cytometry16. There are two different activity-based assays: one and two-stage TF activity assays. The one-stage assay is based on a plasma-based clotting assay. The TF-containing sample is added to plasma and the time to form a clot is measured after re-calcification. The two-stage assay measures FXa generation of samples by adding FVII or FVIIa, FX, and calcium. FXa levels are determined using a substrate that is cleaved by FXa.
In both the one- and two-stage TF activity assays, the TF concentration is determined using a standard curve generated with recombinant TF. Two-stage assays have higher sensitivity and specificity than the one-stage assay. Many studies have confirmed that activity-based assays have higher sensitivity and specificity than antigen-based assays17,18,19,20,21. In addition, our in-house activity assay has higher sensitivity and specificity than a commercial activity assay22. Healthy individuals have very low or undetectable levels of EVTF activity in plasma. In contrast, individuals with pathologic conditions, such as cancer, cirrhosis, sepsis, and viral infection, have detectable levels of EVTF activity and this is associated with thrombosis, disseminated intravascular coagulation, disease severity, and mortality23,24,25,26,27,28. Here, we will describe this in-house two-stage EVTF activity assay.

מחבר זרקור: בדיקת פעילות גורם רקמה ברגישות גבוהה לאבחון פלזמה 

בדיקת פעילות גורם רקמת שלפוחית חוץ-תאית

Low levels of tissue factor-positive extracellular vesicles are present in plasma from patients with different diseases. However, most antigen-based assays, including ELISA and flow cytometry, do not have the sensitivity to detect these low levels. Numerous papers have employed ELISA or flow cytometry to detect tissue factor in plasma.Our protocol measures tissue factor activity in plasma with high sensitivity and specificity, although there is some variability due to the use of a functional assay. There are commercial assay kits that measure levels of tissue factor activity in plasma. However, these kits do not contain anti-tissue factor antibodies, and therefore cannot distinguish between tissue factor-dependent and tissue factor-independent Factor X generation.

תוצאה מוצלחת נותנת ערך בקרה חיובי של ≥0.5 pg/mL וערך בקרה שלילי של <0.5 pg/mL. עדיף למצוא מגיב LPS גבוה עם פעילות EVTF >1.0 pg/mL לשליטה חיובית. התוצאה המייצגת מראה את פעילות ה-EVTF של כלי רכב חשמליים שבודדו מפלזמה מכל הדם של 11 תורמים בריאים, עם וללא הפעלת LPS (איור 4). שישה מתוך אחד עשר תורמים (תור...

Watch this Scientific Journal Video about High-Sensitivity Tissue Factor Activity Assay for Plasma Diagnosis at JoVE.com

כאן אנו מתארים בדיקת פעילות רקמת שלפוחית חוץ-תאית בבית. בדיקות מבוססות פעילות ובדיקות מבוססות אנטיגן שימשו למדידת גורם רקמה בשלפוחיות חוץ-תאיות מדגימות פלזמה אנושיות. לבדיקות מבוססות פעילות יש רגישות וספציפיות גבוהות יותר מאשר בדיקות מבוססות אנטיגן.

Tissue factor (TF) is a transmembrane receptor for factor (F) VII and FVIIa. The TF/FVIIa complex initiates the coagulation cascade by activating both FIX ...

רמות נמוכות של שלפוחיות חוץ-תאיות חיוביות לגורם רקמה קיימות בפלזמה מחולים עם מחלות שונות. עם זאת, לרוב הבדיקות מבוססות האנטיגן, כולל ELISA וציטומטריית זרימה, אין את הרגישות לזהות רמות נמוכות אלה. מאמרים רבים השתמשו ב- ELISA או ציטומטריית זרימה כדי לזהות גורם רקמה בפלזמה.הפרוטוקול שלנו מודד את פעילות פקטור הרקמה בפלזמה עם רגישות גבוהה וספציפיות, אם כי יש שונות מסוימת עקב השימוש בבדיקה פונקציונלית. ישנן ערכות בדיקה מסחריות המודדות את רמות פעילות פקטור הרקמה בפלזמה. עם זאת, ערכות אלה אינן מכילות נוגדנים נגד פקטור הרקמה, ולכן אינן יכולות להבחין בין יצירת פקטור X שאינו תלוי בפקטור רקמה לבין ייצור פקטור X שאינו תלוי ברקמה.

extracellular-vesicle-tissue-factor-activity-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

Extracellular Vesicle Tissue Factor Activity Assay

530 Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. רמות נמוכות של שלפוחיות חוץ-תאיות חיוביות לגורם רקמה קיימות בפלזמה מחולים עם מחלות שונות. עם זאת, לרוב הבדיקות מבוססות האנטיגן, כולל ELISA וציטומטריית זרימה, אין את הרגישות לזהות רמות נמוכות אלה. מאמרים רבים השתמשו ב- ELISA או ציטומטריית זרימה כדי לזהות גורם רקמה בפלזמה.הפרו?...

Video: מחבר זרקור: בדיקת פעילות גורם רקמה ברגישות גבוהה לאבחון פלזמה 

Tissue factor (TF) is a transmembrane receptor for factor (F) VII and FVIIa. The TF/FVIIa complex initiates the coagulation cascade by activating both FIX and FX. TF is released from cells into the circulation in the form of extracellular vesicles (EVs). The level of TF-positive (+) EVs is increased in various diseases, including cancer, bacterial and viral infections, and cirrhosis, and is associated with thrombosis, disseminated intravascular coagulation, disease severity, and mortality. There are two ways to measure TF+ EVs in plasma: antigen- and activity-based assays. Data indicates that activity-based assays have higher sensitivity and specificity than antigen-based assays. This paper describes our in-house EVTF activity assay based on a two-stage FXa generation assay. FVIIa, FX, and calcium are added to the TF+ EV-containing samples to generate FXa in the presence and absence of anti-TF antibody to distinguish TF-dependent FXa generation from TF-independent FXa generation. A chromogenic substrate cleaved by FXa is used to determine the FXa level, while a standard curve generated with a relipidated recombinant TF is used for the determination of the TF concentration. This in-house EVTF activity assay has higher sensitivity and specificity than a commercial TF activity assay.

Here we describe an in-house extracellular vesicle tissue factor activity assay. Activity-based assays and antigen-based assays have been used to measure tissue factor in extracellular vesicles from human plasma samples. Activity-based assays have higher sensitivity and specificity than antigen-based assays.

Extracellular Vesicle Tissue Factor Assay with Blood Plasma Derived Extracellular Vesicles

To begin, defrost the isolated blood plasma samples at 37 degrees Celsius. Transfer 100 microliters of each plasma sample into 1.5-milliliter tubes. Add one milliliter of calcium-free HBSA buffer to each tube.Centrifuge the samples at 20, 000 g for 15 minutes at four degrees Celsius. Aspirate the supernatant to 20 microliters without disturbing the pellet. Next, add one milliliter of the calcium-free HBSA buffer to each tube.Then pipette up and down to reconstitute the pellet. Vortex each tube for a few seconds to ensure equal distribution of the extracellular vesicles. Then centrifuge at 20, 000 g for 15 minutes at four degrees Celsius.Again, aspirate the supernatant to 20 microliters without disturbing the pellet. Then reconstitute the pellet in 80 microliters of calcium-free HBSA buffer. Pipette the suspension up and down to obtain an even suspension.To measure the extracellular vesicle tissue factor activity, first, pipette 40 microliters of the extracellular vesicle sample into two wells of a 96-well plate. Into the first well, add 11 microliters of an inhibitory mouse anti-human TF IgG. To the other well, add 11 microliters of control mouse IgG.After incubation, add 50 microliters of the factor mix solution into each well. Cover the plate with film, then incubate the plate for two hours at 37 degrees Celsius. Add 25 microliters of HBSA EDTA buffer to stop the factor Xa generation.Reconstitute the chromogenic substrate in distilled water to a concentration of four millimoles. Now add 25 microliters of the chromogenic substrate into each well. Cover the plate with film and then wrap it in aluminum foil.Incubate the plate at 37 degrees Celsius for 15 minutes. Next, centrifuge the plate at 1, 500 g for one minute to remove any bubbles. Then place the plate in a plate reader at 405 nanometers.Use the standard curve generated with relipidated recombinant tissue factor to convert the factor Xa generation of each well. Then calculate the tissue factor-dependent factor Xa generation. Six out of 11 donors were medium to high lipopolysaccharide responders, whereas five out of 11 donors were low lipopolysaccharide responders.