אנו מודים לאלן וינסנט על קריאתו הביקורתית של כתב היד. אנו מודים לרות להמן על מתן הנוגדן Zfh1. אנו מודים על עזרתם של סטפני דוטרטר וחאווייר פינסון למיקרוסקופ קונפוקלי בפלטפורמת ההדמיה MRic. EL נתמכת על ידי מלגת דוקטורט מטעם ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA נתמך על ידי AFM-Telethon Ph.D. fellowship 23846. TP ממומן על ידי מענק DAF של יוזמת צוקרברג ל- T.P. (2019-198009). HB נתמך על ידי CNRS, תוכנית Atip Avenir ומענק הטרמפולינה AFM-Telethon 23108.

1. דיסקציה והכנה של דיסק כנף ושרירים בוגרים
הערה: נקה את ספסל הדיסקציה ואת כל מכשירי הדיסקציה באמצעות תמיסת מעכבי RNAse (טבלת חומרים). יש ללבוש כפפות מעבדה במהלך כל הליך הניסוי.
<ol><li>דיסק כנף
	<ol><li>הניחו את הזחלים המבוימים L3 במי מלח קרים חוצצי פוספט 1x (PBS) (איור 1A).</li>
		<li>שטפו את הזחלים 3x עם 1x PBS ושמרו אותם בתמיסה זו למשך 5 דקות.</li>
		<li>בעזרת שני זוגות מלקחיים חדים, מחזיקים את הזחל מהחלק הקדמי ומושכים ומשליכים את שאר רקמות הגוף (בסביבות 2/3).</li>
		<li>החזיקו את 1/3 הזחל הראשון עם זוג מלקחיים אחד ואת ווי הפה עם הזוג השני. משכו את ווי הפה בתוך הזחל עד שהוא הפוך לחלוטין. הערה: נתח כ-30 זחלים בכל ניסוי, כדי להבטיח גודל מדגם מתאים לניתוח.</li>
		<li>שימו לב שדיסקיות הכנף קשורות קשר הדוק לשני הענפים העיקריים של קנה הנשימה, העוברים לאורך כל צד של הזחל.</li>
		<li>הסירו את כל מרכיבי הזחל האחרים (דיסקיות רגליים ומוח) כדי לקבל פגר זחל הפוך ונקי עם זוג דיסקיות כנף המחוברות לקנה הנשימה (איור 1B).</li>
		<li>הניחו את הדגימות בצינור צנטריפוגה בנפח 1 מ"ל וקיבעו אותן ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) מדולל ב-1x PBS למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה. הערה: תסיסה לדוגמה מושגת על ידי מערבל מתנדנד (טבלה של חומרים).</li>
		<li>לשטוף את הדגימות 3 x 5 דקות עם אתנול 70% (EtOH, מדולל במים ללא RNAse) ולאחסן אותם באותה תמיסת כביסה ב 4 ° C לפחות 2 ימים ועד 1 שבוע.</li>
	</ol></li>
	<li>שרירי טיסה עקיפים
	<ol><li>הרדימו את הזבובים הבוגרים על משטח זבובCO2 והסירו את הראשים, הבטן, הרגליים והכנפיים.</li>
		<li>הניחו את בית החזה המנותח ב-PBS 1x קר והמשיכו לעשות זאת עד שכל הדגימות ינותחו (איור 1D).</li>
		<li>מקדמים את בית החזה ב-4% PFA, (1% טריטון) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה.</li>
		<li>שטפו את הדגימות 3 x 5 דקות עם תמיסת כביסה 1x PBT (1% טריטון ב-1x PBS).</li>
		<li>מקמו את בית החזה על סרט דו-צדדי (Table of Materials) על מגלשת זכוכית וחתכו אותם עם להב מיקרוטום חד כדי לייצר שני המי-תורקסים (איור 1E,F).</li>
		<li>תקן את הדגימות ב 4% PFA (1% טריטון) במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה.</li>
		<li>יש לכבס 2 x 20 דקות עם תמיסת כביסה PBT אחת (1% טריטון, 1x PBS) בטמפרטורת החדר תחת תסיסה.</li>
		<li>הניחו את המי-תוראס ב-PBS 1x קר והשתמשו במלקחיים כדי לבודד בעדינות את ה-IFMs מההמי-תוראס (איור 1G). הערה: כדי להשיג זאת, חשוב להסיר את הקוטיקולה ביסודיות ככל האפשר.</li>
		<li>כדי לחלחל את הדגימות, לאחסן את IFMs מבודדים בתמיסת 70% EtOH לפחות 2 ימים ועד שבוע אחד ב 4 ° C. הערה: בודד את ה- IFMs מכ- 10 בתי חזה לכל ניסוי כדי להבטיח גודל מדגם מתאים לניתוח.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכלאה, אימונוסטיין והרכבה
הערה: הליך הכלאה דומה מיושם הן עבור דיסקיות כנף והן עבור דגימות IFMs. חשוב מאוד לבודד את דיסקיות הכנף מפגרי הזחלים ולהכניס אותן ל-200 מיקרוליטר של חיץ A לפני תחילת ההכלאה.
<ol><li>השהה מחדש את הגשושיות ב 400 μL של חיץ TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) לקבלת פתרון מלאי סופי של 12.5 מיקרומטר.</li>
	<li>מעבירים את הדגימות לצינור צנטריפוגה בנפח 0.5 מ"ל המכיל חיץ A (טבלת חומרים). הערה: על ידי הקטנת נפח המיכל, קל יותר לדמיין את הדגימות ולהימנע מאיבודן במהלך תהליך הכביסה.</li>
	<li>שטפו את הדגימות 2 x 20 דקות עם Buffer A.</li>
	<li>שאפו את חיץ A, החליפו אותו ב-400 μL של חיץ ההכלאה (Table of Materials), ובצעו הכלאה מוקדמת של הדגימות למשך 30 דקות ב-37°C במערבל תרמי (Table of Materials).</li>
	<li>מדללים את הגשושיות לריכוז סופי של 125 ננומטר לדיסקיות כנף ו-200 ננומטר לשרירים בוגרים, במאגר ההכלאה ומוסיפים את הנוגדן הראשוני. הערה: דילול הנוגדנים משתנה בהתאם לנוגדן הספציפי שבו נעשה שימוש (רשימת חומרים). הוספת נוגדנים היא אופציונלית. משתמשים יכולים לבחור לוותר על צביעת חלבונים ובמקום זאת להשתמש בפרוטוקול smFISH דומה שאינו כולל תוספת נוגדנים.</li>
	<li>שאפו את חיץ ההכלאה והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטר של חיץ הכלאה המכיל את הבדיקה ואת הנוגדן.</li>
	<li>יש לדגור על הדגימות בחושך בטמפרטורה של 37°C למשך 16 שעות לפחות מתחת ל-300 סל"ד במערבל תרמי.</li>
	<li>חימום aliquot של חיץ A ב 37 °C (75 °F).</li>
	<li>שטפו את הדגימות במשך 3 x 10 דקות במערבל התרמי בטמפרטורה של 37°C מתחת לתסיסה של 300 סל"ד.</li>
	<li>במהלך השטיפה האחרונה, לדלל את הנוגדן המשני (1/200) ואת DAPI (1/10,000) בחיץ A ולדגור את הדגימות בתמיסה זו ב 37 ° C במשך 1 שעה לפחות.</li>
	<li>שטפו את הדגימות במשך 3 x 20 דקות עם Buffer B (טבלת חומרים).</li>
	<li>העבירו בזהירות את הדגימות בשקופית מיקרוסקופ, נגבו את שאריות החיץ B, הוסיפו 30 μL של אמצעי הרכבה, וכסו בכיסוי של 18 x 18 מ"מ. השתמשי בלק כדי לאטום את התכשיר.</li>
	<li>אחסן את הדגימות עד שבוע אחד ב 4 ° C. הערה: עם זאת, מומלץ לבצע את ההדמיה בהקדם האפשרי כדי למנוע השפלה של אות הבדיקה.</li>
</ol>3. הדמיה
<ol><li>קבל תמונות במצב רכישת xyz באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במטרות טבילת שמן 40x ו- 63x (טבלת חומרים). אות smFISH מזוהה על ידי גלאי HyD באמצעות מצב ספירת פוטונים.</li>
	<li>אתר את הדגימות באמצעות אות DAPI ומנורת UV.</li>
	<li>כדי לצלם את אבות השרירים הקשורים לדיסק הכנף ואת ה-IFMs (איור 2 ואיור 3), החל את ההגדרה הבאה עבור קווי לייזר ומסנני פליטה: בחר DAPI (עירור (לדוגמה) 405 ננומטר, פליטה (em.) 450 ננומטר), Alexa Fluor 488 (לדוגמה 496 ננומטר, em. 519 ננומטר), וקוואזר 670 עבור בדיקות smFISH (לדוגמה 647 ננומטר, em. 670 ננומטר).</li>
	<li>כדי לצלם את ה-MuSCs למבוגרים (איור 2D), החל את ההגדרה הבאה עבור קווי לייזר ומסנני פליטה: בחר DAPI (לדוגמה 405 ננומטר, em. 450 ננומטר), Alexa Fluor 488 (לדוגמה 496 ננומטר, em. 519 ננומטר), Alexa Fluor 555 (לדוגמה 555 ננומטר, em. 565 ננומטר), וקוואזר 670 עבור בדיקות smFISH (לדוגמה 647 ננומטר, em. 670 ננומטר). הערה: לצורך ההדמיה, ניתן להתאים את אורכי הגל בהתאם לצבעים הקשורים לנוגדנים ובדיקות משניים.</li>
	<li>שמור את התמונות הקונפוקליות כ- . קובצי TIFF.</li>
</ol>4. ניתוח לאחר הדמיה
<ol><li>כדי להתחיל, הפעל את ImageJ ונווט לתפריט תוספים . משם, בחר פקודות מאקרו | ערוך כדי לפתוח את קוד המקור של פקודות המאקרו. הערה: פעולה זו תאפשר התאמה של הפרמטרים לפי הצורך, ובמידת הצורך, תשנה את ספריית התיקיות עבור כל ערוץ בתוך קוד המקור של המאקרו.</li>
	<li>כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה ולכמת כתמי Mef2 smFISH בזחלים, השתמש בהגדרות הבאות: Log_radius = 3.0 ו- Log_quality = 20.0. גרעיני סגמנט Mef2 חיוביים עם טשטוש = 2; nucleus_scale_parameter = 30; nucleus_threshold = -8.0; nucleus_size = 300.</li>
	<li>בסיבי שריר, השתמש בפרמטרים הבאים: Log_radius = 2.5; Log_quality = 60.0; טשטוש = 2; nucleus_scale_parameter = 100; nucleus_threshold = 0.0; nucleus_size = 300.</li>
	<li>כדי להפעיל את המאקרו, פשוט הפעל את פקודת ההפעלה והמתן עד שהמאקרו יטען באופן אוטומטי את כל התמונות מהתיקייה המיועדת ויכמת אותן באופן רציף. הערה: שים לב שמשך התהליך עשוי להשתנות בין מספר שניות למספר שעות, בהתאם לנפח הנתונים המנותחים.</li>
	<li>חפש את התוצאות המוצגות בשני קבצי .csv חדשים: file_FISH_results ו- file_nuclei_results. הראשון מציג את מספר כתמי השעתוק ואת עוצמתם הממוצעת והמקסימלית. השני נותן גם את המספר הכולל של גרעינים וגם את מספר הכתמים בתוך כל גרעין.</li>
</ol>

איתור וכימות מולקולות mRNA בודדות בדרוזופילה

<ol>
	<li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Chal, J., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+muscle:+skeletal+myogenesis+in+vivo+and+in+vitro.">Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro.</a> Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).</li><li>Taylor, M. V., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mef2+and+the+skeletal+muscle+differentiation+program.">Mef2 and the skeletal muscle differentiation program.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).</li><li>Siles, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEB1+imposes+a+temporary+stage-dependent+inhibition+of+muscle+gene+expression+and+differentiation+via+CtBP-mediated+transcriptional+repression.">ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).</li><li>Weitkunat, M., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+study+Drosophila+muscle+biology.">A guide to study Drosophila muscle biology.</a> Methods. 68 (1), 2-14 (2014).</li><li>Boukhatmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+an+integrative+model+to+study+the+features+of+musclestem+cells+in+development+and+regeneration.">Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration.</a> Cells. 10 (8), 2112 (2021).</li><li>Bothe, I., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+myogenesis.">Drosophila myogenesis.</a> Current Biology. 26 (17), R786-R791 (2016).</li><li>Catalani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+is+evolutionary+conserved+in+satellite+stem+cell+activation+and+adult+skeletal+muscle+regeneration.">RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration.</a> Cell Death Discovery. 8 (1), 459 (2022).</li><li>Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZEB1+protects+skeletal+muscle+from+damage+and+is+required+for+its+regeneration.">ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration.</a> Nature Communications. 10 (1), 1364 (2019).</li><li>Boukhatmi, H., Bray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+adult+satellite-like+cells+in+Drosophila+is+maintained+through+a+switch+in+RNA-isoforms.">A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms.</a> Elife. 7, e35954 (2018).</li><li>Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+muscle+satellite+cells+in+Drosophila.">Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila.</a> Elife. 6, e30107 (2017).</li><li>Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+new+stem+cell+population+that+generates+Drosophila+flight+muscles.">Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles.</a> Elife. 3, e03126 (2014).</li><li>Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+stem+cells+and+model+systems+for+their+investigation.">Muscle stem cells and model systems for their investigation.</a> Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).</li><li>Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+niche-driven+insulin-Notch-Myc+cascade+reactivates+dormant+adult+muscle+precursors+in+Drosophila.">Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila.</a> Elife. 4, e08497 (2015).</li><li>Schonbauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spalt+mediates+an+evolutionarily+conserved+switch+to+fibrillar+muscle+fate+in+insects.">Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects.</a> Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).</li><li>Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirements+for+Myocyte+Enhancer+Factor-2+during+adult+myogenesis+in+Drosophila.">Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila.</a> Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).</li><li>Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conserved+transcription+factor+Mef2+has+multiple+roles+in+adult+Drosophila+musculature+formation.">The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation.</a> Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).</li><li>Soler, C., Taylor, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Him+gene+inhibits+the+development+of+Drosophila+flight+muscles+during+metamorphosis.">The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis.</a> Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).</li><li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+distribution+in+skeletal+muscle+is+associated+with+mRNA+size.">mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size.</a> Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388 (2021).</li><li>Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-based+transport+is+essential+to+distribute+RNA+and+nascent+protein+in+skeletal+muscle.">Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle.</a> Nature Communications. 12 (1), 6079 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly+Cell+Atlas:+A+single-nucleus+transcriptomic+atlas+of+the+adult+fruit+fly.">Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly.</a> Science. 375 (6584), eabk2432 (2022).</li><li>Santos, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+sequencing+of+single+nuclei+from+murine+skeletal+muscles.">Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).</li><li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellpose:+a+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation.">Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li><li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackMate:+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking.">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li><li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoLibJ:+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ.">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li><li>Mueller, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH-quant:+automatic+counting+of+transcripts+in+3D+FISH+images.">FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images.</a> Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).</li><li>Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BayFish:+Bayesian+inference+of+transcription+dynamics+from+population+snapshots+of+single-molecule+RNA+FISH+in+single+cells.">BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells.</a> Genome Biology. 18 (1), 164 (2017).</li><li>Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+imaging.+Spatially+resolved,+highly+multiplexed+RNA+profiling+in+single+cells.">RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells.</a> Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

היישום של שיטת smFISH צבר פופולריות בתקופה האחרונה, כאשר השימוש בו משתרע על סוגי תאים שונים ואורגניזמים מודל. עם זאת, במקרה של דרוזופילה, רוב הידע על ביטוי גנים של שרירים בוגרים נגזר מבדיקות מולקולריות בתפזורת, שאינן מספקות מידע כמותי על המיקום המרחבי המדויק של מולקולות mRNA. כדי להתמודד עם פער זה, ביצענו אופטימיזציה של שיטה לביצוע smFISH על תאים מקדימים של שריר ושרירי דרוזופילה בוגרים. גישה זו הותאמה מפרוטוקול23 שפורסם בעבר והותאמה לרקמות שריר דרוזופילה .
המכשול העיקרי בהשגת תמונות smFISH באיכות גבוהה הוא עובי השרירים הבוגרים, המעכב את החדירה האופטימלית של הבדיקות. לכן, חשוב להפריד את השרירים הבוגרים משאר רקמות החיה ולבצע את תהליך ההכלאה עם תסיסה קלה. שלב מסוים זה מבטיח חלחול יעיל של הרקמות.
היבט קריטי נוסף הוא שיחס אות לרעש יכול לגרום לצנרת החישובית להיכשל באיתור כתמי mRNA מסוימים. מצאנו כי הגדלת יחס האות לרעש יכולה להיות מושגת על ידי מציאת הריכוז האופטימלי של גשושיות. הדילול האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם להרכב של כל קבוצת בדיקה, כולל צבע מצומד והרכב אוליגונוקלאוטידים. אנו ממליצים לנסות דילולים שונים; דילול סופי של 200 ננומטר הניב את יחס האות לרעש הטוב ביותר עבור רקמות בוגרות בניסויים אלה.
בשיטת smFISH ניתן לכמת את מספר הרנ"א המסונתז החדש במוקדי TS. כאשר גן משועתק באופן פעיל, מספר רנ"א מתהווה מיוצרים בו זמנית ב-TS. כתוצאה מכך, עוצמת ה-TS תעלה על זו של רנ"א ציטופלזמי בוגר, ותכונה זו, בשילוב עם הלוקליזציה הגרעינית שלו, יכולה להבדיל בין ה-TS לבין רנ"א ציטופלזמי בודד. בהקשר של ביולוגיה של שרירים, זיהוי וכימות TS חשובים במיוחד לקביעת הסנכרון של שעתוק של גן מסוים בין גרעיני שריר בתוך אותו סינציטיום. עם זאת, צינור חישובי זה אינו מתוכנן להבדיל בין mRNA ציטופלזמי לבין אותות TS. כחלופה, אנו מציעים לשלב שיטת smFISH זו עם כלי ניתוח smFISH מבוססים אחרים, כגון BayFISH או FISH-quant29,30. כלים אלה הוכחו כמאפשרים סגמנטציה אוטומטית וחישובי עוצמת פלואורסצנטיות של צברי RNA בדיוק יוצא דופן.
לבסוף, בעוד smFISH מזהה מולקולות mRNA עם רזולוציה מרחבית גבוהה, הוא מוגבל לניתוח מספר קטן של mRNA בו זמנית. שיטות רב-ממדיות כמו merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) מאפשרות ניתוח סימולטני של מספר רב של mRNA31 שונים. על ידי שילוב של בדיקות אוליגונוקלאוטידים וקודים לתיקון שגיאות, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מאות מיני RNA בתאים בודדים.

שרירי השלד הבוגרים עשויים מסיבים מרובי גרעינים מובחנים שתכונות ההתכווצות שלהם מייצרות תנועות. גדילה, תחזוקה והתחדשות שרירים מסתמכים על אבות שריר ותאי גזע שריריים (MuSCs) המוגדרים במהלך ההתפתחות העוברית1. התוכנית המיוגנית נשלטת היטב על ידי קבוצה של גורמי שעתוק מיוגני ליבה (TFs) (למשל, Pax3/7, MYOD, Mef2 ו- ZEB)2,3,4. פענוח המנגנונים המולקולריים המווסתים את הביולוגיה של השרירים חשוב להבהרת שאלות יסוד הקשורות למיולוגיה ולשימוש טיפולי אפשרי בטיפול במחלות ניווניות שרירים.
לדרוזופילה יש היסטוריה ארוכה כמודל גנטי לחקר מיוגנזה5. לאחרונה הוא התגלה כמודל חדש לחקר התחדשות שרירים 6,7,8. מבנה השרירים ותוכניות הליבה המיוגניות נשמרים מאוד בין זבובים ליונקים. לדוגמה, ל-TFs Mef2 ו-Zfh1/ZEB יש תפקיד שמור בוויסות התפתחות והתחדשות שרירים 3,9,10,11. שרירי דרוזופילה בוגרים, כגון שרירי הטיסה העקיפה (IFMs), נוצרים מאוכלוסייה ספציפית של MuSCs, המכונים אבות שרירים בוגרים (AMPs)12. AMPs אלה מוגדרים במהלך האמבריוגנזה וקשורים למבני אפיתל כגון דיסקים בכנף וברגליים. לאורך כל שלבי העובר והזחל, AMPs נשארים בלתי ממוינים עד למטמורפוזה כאשר הם עוסקים בהתמיינות ואיחוי ליצירת IFMs13,14. TF Spalt major (spalt, salm) מתבטא במהלך התפתחות שרירי הטיסה ויש צורך לקבוע את זהותם המבנית15. Mef2 הוא TF מיוגני חשוב נוסף החיוני ליצירת שרירים בוגרים16,17. זה בא לידי ביטוי AMPs ונשמר במבוגרים IFMs10,18. בעוד שרוב ה-AMPs מתמיינים לשרירים פונקציונליים, תת-קבוצה חומקת מהתמיינות ויוצרת את MuSCs11 הבוגרים. בדומה לבעלי חוליות, TF Zfh1/ZEB נדרש כדי למנוע התמיינות מוקדמת של MuSCs בוגרים ולשמור על גזעם 9,10.
דינמיקה של ביטוי גנים הוכחה כמווסתת תהליכים ביולוגיים שונים של שרירים19,20. הופעתן של טכניקות ריצוף RNA חד-תאי וחד-גרעיני בתפוקה גבוהה אפשרה חקירה מקיפה של דינמיקות שעתוק אלה21,22. מגבלה בולטת אחת של גישות אלה היא חוסר יכולתן לספק את הפיזור המרחבי של מולקולות mRNA בסיבי השריר מרובי הגרעין. תכונות אלה יכולות להיחקר על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו של מולקולה בודדת (smFISH) החושפת שני סוגים של גופי mRNA: 1. מולקולות mRNA בודדות המפוזרות בציטופלסמה ומייצגות את הרנ"א הבוגר ו-2. שני מוקדים גרעיניים בהירים לכל היותר תואמים את התעתיק המתהווה וחושפים את האללים הפעילים בשעתוק23. לכן, smFISH היא שיטה מועדפת לכימות מולקולות mRNA בודדות, החוקרת את ההתפלגות המרחבית שלהן ומספקת תמונות של דינמיקת השעתוק של הגנים.
שיטת smFISH מסתמכת על סדרה של בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיות קצרות שתוכננו במיוחד כדי להיות משלימות את תעתיק המטרה. עם החישול, הוא מייצר מקורות נקודתיים בעוצמה גבוהה המאפשרים זיהוי של mRNA ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי24. שיטה זו מיושמת יותר ויותר עבור מגוון רחב של סוגי תאים, כולל רקמות שריר יונקים19,20. עם זאת, בדרוזופילה, כמו במודלים אחרים של בעלי חיים, רוב הידע על ביטוי גנים של שרירים בוגרים נגזר מבדיקות מולקולריות בתפזורת, אשר חסרות מידע כמותי על המיקום המרחבי של מולקולות mRNA. כאן ביצענו אופטימיזציה של שיטה לביצוע smFISH על תאים מבשרי שריר ושרירי דרוזופילה בוגרים23,25. פרוטוקול זה כולל צינור ניתוח אוטומטי לחלוטין עבור סגמנטציה של גרעינים וספירת mRNA ולוקליזציה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confocal microscope SP8</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8 DMI 6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>62248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape&#160;</td>
			<td>Tesa&#160;</td>
			<td>57910-00000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 16%</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EM-15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mef2 antibody</td>
			<td>DHSB</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>ET330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZAP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellaris probes</td>
			<td>LGC</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer</td>
			<td>LGC</td>
			<td>SMF-HB1-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellaris RNA FISH Wash Buffer A</td>
			<td>LGC</td>
			<td>SMF-WA1-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stellaris RNA FISH Wash Buffer B</td>
			<td>LGC</td>
			<td>SMF-WB1-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swann-Morton Blades</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-mCD8::GFP line</td>
			<td>Bloomington</td>
			<td>RRID:BDSC_5137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch Glass, Square, 1 5/8 in&#160;</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>742300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zfh1 antibody</td>
			<td>Gifted by Ruth Leahman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zfh1-Gal4</td>
			<td>Bloomington</td>
			<td>BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying muscle transcriptional dynamics at single-molecule scales in drosophila

שרירי השלד הם סינסיטיה גדולה המורכבת ממיופיבים צרורים רבים המייצרים כוחות ומאפשרים תנועת גוף. דרוזופילה היא מודל קלאסי לחקר ביולוגיה של שרירים. השילוב של גנטיקה של דרוזופילה וגישות אומיקה מתקדמות הוביל לזיהוי מולקולות מפתח שמורות המווסתות מורפוגנזה והתחדשות שרירים. עם זאת, דינמיקת השעתוק של מולקולות אלה וההתפלגות המרחבית של הרנ"א השליח שלהן בתוך הסינקיטיה אינן ניתנות להערכה בשיטות קונבנציונליות. כאן ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה קיימת של RNA פלואורסצנטי באתרו (smFISH) של מולקולה בודדת כדי לאפשר זיהוי וכימות של מולקולות mRNA בודדות בתוך שרירי תעופה בוגרים ותאי גזע השריר שלהם. כהוכחת היתכנות, ניתחנו את ביטוי ה-mRNA ואת התפלגות שני גורמי שעתוק אבולוציוניים שמורים, Mef2 ו-Zfh1/Zeb. אנו מראים כי שיטה זו יכולה לזהות ולכמת ביעילות מולקולות mRNA בודדות עבור שני התעתיקים בתאים מקדימים של שריר, שרירים בוגרים ותאי גזע שריר.

Adult skeletal muscles are made of differentiated multinucleated myofibers whose contractile properties generate movements. Muscle growth, maintenance, and regeneration rely upon muscle progenitors and muscle stem cells (MuSCs) that are specified during embryonic development1. The myogenic program is finely controlled by a set of core myogenic transcription factors (TFs) (e.g., Pax3/7, MYOD, Mef2, and ZEB)2,3,4. Deciphering the molecular mechanisms regulating muscle biology is important for elucidating fundamental myology-related questions and for possible therapeutic use in treating muscle-degenerative diseases.
Drosophila has a long history as a genetic model to study myogenesis5. It has recently emerged as a new model to investigate muscle regeneration6,7,8. The muscle structure and core myogenic programs are highly conserved between flies and mammals. For example, the TFs Mef2 and Zfh1/ZEB have a conserved function in regulating muscle development and regeneration3,9,10,11. Adult Drosophila muscles, such as the Indirect Flight Muscles (IFMs), are formed from a specific population of MuSCs, known as Adult Muscle Progenitors (AMPs)12. These AMPs are specified during embryogenesis and associate with epithelial structures such as wing and leg discs. Throughout embryonic and larval stages, AMPs remain undifferentiated until metamorphosis when they engage in differentiation and fusion to form the IFMs13,14. The TF Spalt major (spalt, salm) is expressed during flight muscle development and is necessary to determine their structural identity15. Mef2 is another important myogenic TF that is essential for adult muscle formation16,17. It is expressed in the AMPs and maintained in the adult IFMs10,18. While the majority of AMPs differentiate into functional muscles, a subset escapes differentiation and forms the adult MuSCs11. Similar to vertebrates, the TF Zfh1/ZEB is required to prevent premature differentiation of the adult MuSCs and to maintain their stemness9,10.
Gene expression dynamics have been proven to regulate various muscle biological processes19,20. The advent of high-throughput single-cell and single-nuclei RNA sequencing techniques has enabled a comprehensive exploration of these transcriptional dynamics21,22. One notable limitation of these approaches is their inability to provide the spatial distribution of mRNA molecules in the multinucleated muscle fibers. These features can be investigated by single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) that reveals two types of mRNA bodies: 1. Individual mRNA molecules spread out in the cytoplasm and representing the mature RNA and 2. A maximum of two bright nuclear foci correspond to the nascent transcript and reveal the transcriptionally active alleles23. Therefore, smFISH is a method of choice for individual mRNA molecule quantification, investigating their spatial distribution and providing snapshots of the gene transcriptional dynamics.
The smFISH method relies on a set of short fluorescent oligonucleotide probes specifically designed to be complementary to the target transcript. Upon annealing, it generates high-intensity point sources permitting the detection of mRNA at a single-molecule level using confocal microscopy24. This method is increasingly applied for a wide variety of cell types, including mammalian muscle tissues19,20. However, in Drosophila like other animal models, most of the knowledge about adult muscle gene expression is derived from bulk molecular assays, which lack quantitative information on the spatial location of mRNA molecules. Here we optimized a method for performing smFISH on muscle precursor cells and adult Drosophila muscles23,25. This protocol includes a fully automated analysis pipeline for nuclei segmentation and mRNA counting and localization.

מחבר זרקור: חקירת התפלגות מרחבית mRNA ברקמת שריר דרוזופילה 

חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה

In our team, we studied the cellular and molecular mechanisms governing muscle development and repair. In fact, the special distribution of mRNA molecules is known to regulate various cellular processes. And here, we use the Drosophila as a model to investigate how the mRNAs are especially distributed within the fly's muscle tissue.Gene expression dynamic have been proven to regulate various muscle biological process. The advent of high-throughput single cell and single nuclei RNA sequencing techniques has enabled a comprehensive exploration of the transcriptional dynamics. One notable limitation of classical omics techniques is an inability to provide those spatial distribution of mRNA molecules within the Drosophila muscle fibers.This feature can be investigated by single molecule fluorescence in situ hybridization. Current methods are insufficient to determine the mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within Drosophila muscle system. To address this limitation, we optimized a method to detect and to codify the individual mRNA molecules in Drosophila muscle fibers with high spatial resolution and signal molecule scales.A current challenge in the field is to visualize the muscle regeneration dynamic in real time and in living animal. That's why we are trying to develop a live imaging approach to visualize the muscle stem cell behavior in their native environment, and also to address the question of their mode and range of migration, for example, during the muscle regeneration and also their differentiation and this with unprecedented resolution.

בפרוטוקול זה, השתמשנו בגשושיות שיוצרו באופן מסחרי המכוונות ל-Mef2 ו-zfh1 mRNA. תכננו את הגשושיות עם מעצב הגשושיות FISH של היצרן (Table of Materials). Mef2 מציב מטרות לאקסונים המשותפים לכל איזופורמים של רנ"א Mef2 (מאקסון 3 עד אקסון 10). zfh1 הציב מטרות לאקסון השלישי המשותף הן לאיזופורמים zfh1-RB והן לאיזופורמים10 של zfh1-RE. שתי הגשושיות מצומדות לצבע הפלואורסצנטי Quasar 670.
יצרנו מאקרו פנימי שהיה תואם לתוכנת ImageJ כדי לנתח באופן אוטומטי את נתוני .tif הגולמיים. המאקרו מאפשר פילוח תלת ממדי של הגרעינים על ידי Cellpose26 עם תוסף פיג'י BIOP וכימות נקודות שעתוק על ידי Laplacian של גאוס כפי שמיושם בתוסף Trackmate27. תוסף MorpholibJ28 משמש לעיבוד מאוחר (קובץ משלים 1).
כצעד ראשון, ביצענו smFISH על דיסקים דמיוניים של כנף, כאשר Mef2 ו-zfh1 ידועים כבאים לידי ביטוי ב-AMPs. נתונים אלה מראים ששני התעתיקים מזוהים באופן אחיד באוכלוסיית AMPs המוכתמת בנוגדנים Mef2 או Zfh1 (איור 2A,B). ניתן לחשוף ולהבדיל בין אתרי שעתוק פעילים (TS) לבין mRNA בוגר על ידי smFISH מכיוון שהם נוטים להיות גדולים יותר ובעלי אותות חזקים יותר מתעתיקים ציטופלזמיים בודדים או מתעתיקי גרעין בוגרים. באופן עקבי, הגדלות גבוהות יותר של AMPs מבחינות בין מוקדי TS לבין mRNA בוגר המפוזר בציטופלסמה (איור 2A',B'), מה שמאמת את הרגישות של פרוטוקול smFISH זה. עם זאת, יש לציין שראינו TS פעיל אחד לכל גרעין גם עבור zfh1 וגם עבור Mef2 (איור 2A',B'). נתונים אלה מאמתים עוד יותר את הדיוק של תכנון הגשושית מאחר שתבניות השעתוק Mef2 ו-zfh1 ב-AMPs משתלבות יחד עם זיהוי החלבונים שלהן (איור 2).
בשלב שני, בחנו את אתר השעתוק והתפוצה של Mef2 ו-zfh1 mRNA ב-IFMs בוגרים ממוינים ובתאי גזע קשורים (איור 2C,D). הנתונים האלה מדגימים בבירור Mef2 TSs בגרעין השריר הסינקטיאלי ובפיזור Mef2 mRNA בכל הציטופלסמה (איור 2C,C'). Zfh1 מציין באופן ספציפי את אוכלוסיית MuSCs10,11. באמצעות פרוטוקול smFISH זה, זיהינו בהצלחה תעתיק zfh1 ב- MuSCs המסומנים בביטוי Zfh1-Gal4 >- GFP. הגדלה גבוהה יותר מדגימה זיהוי של zfh1 TS ושל mRNA יחיד ציטופלזמי (איור 2D').
לבסוף, השתמשנו במאקרו ImageJ שנבנה בתוך החברה שלנו כדי לנתח כמותית את דינמיקת השעתוק Mef2 ואת ההתפלגות המרחבית. הצינור החישובי יכול לזהות ולפלח ביעילות נקודות Mef2 וגרעיני שריר (איור 3A-C). עם זאת, עקב בעיות ביחס אות לרעש, ייתכן שחלק מהכתמים לא יזוהו במקרים מסוימים (איור 3A',B'). השתמשנו בשיטה אוטומטית זו כדי לחקור אם שפע Mef2 mRNA משתנה בין תאים מקדימים של שריר (AMPs) לבין IFM מבוגרים ממוינים. הניתוח שלנו מראה שמספר ה-Mef2 mRNA לגרעינים ב-IFMs בוגרים וב-AMPs אינו שונה באופן משמעותי (איור 3D).
כדי לקבל תובנה לגבי ההתפלגות המרחבית של תעתיקי Mef2 בשרירי IFM בוגרים, כימתנו את החלק של כתמי mRNA ציטופלזמיים לעומת גרעיניים של Mef2 (איור 3E,F). באמצעות התוכנית שלנו, ספרנו הן את המספר הכולל של כתמי Mef2 mRNA והן את מספר כתמי Mef2 mRNA החופפים לצביעת גרעינים (Mef2). הפחתת ה-mRNA הקשור לגרעינים ממספר ה-mRNA הכולל מספקת את מספר כתמי ה-mRNA הציטופלזמיים. הממצאים שלנו מגלים שכ-92% מ-Mef2 mRNA נמצאים בציטופלסמה, בעוד ש-8% הנותרים קשורים לגרעיני שריר, כפי שמוצג באיור 3E,F.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65713/65713fig1v2.jpg"> איור 1: הליך לניתוח והכנה של דיסקיות כנף ודגימות IFM עבור smFISH. (A) זחלים מבוימים L3. (B) קצה קדמי מנותח והפוך של הזחל. חצים מציינים את דיסקיות הכנפיים. (C) דיסק כנף מבודד. (D) בית חזה בוגר מנותח. (E) בית החזה הבוגר מכוון על סרט דו-צדדי לפני חתך (קו מקווקו). (F) המיטורקס למבוגרים. (G) IFMs מבודדים. (H) זרימת עבודה של פרוטוקול smFISH. קיצורים: IFMs = שרירי טיסה עקיפים; smFISH = RNA פלואורסצנטי של מולקולה אחת באתרו ; EtOH = אתנול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65713/65713fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65713/65713fig2v2.jpg"> איור 2: תמונות מייצגות של Mef2 ו-zfh1 smFISH בדיסקי כנף וב-IFM בוגרים. (A,B) Mef2 ו-zfh1 mRNA (סגול) מזוהים באופן אחיד ב-AMPs ומבצעים לוקליזציה משותפת עם חלבוני (A,A') Mef2 ו-(B,B') Zfh1 (ירוק), בהתאמה. (א', ב'') הגדלה גבוהה יותר של AMPs. (C) Mef2 mRNA וחלבון Mef2 מזוהים ב-IFM למבוגרים. (ג') הגדלה גבוהה יותר של האזור הארוז ב- C. (D) Zfh1-Gal4 >ביטוי UAS-mCD8GFP (ירוק) מסמן MuSCs למבוגרים. ZFH1 RNA מזוהה ב- MuSCs בוגרים. (ד') הגדלה גבוהה יותר של האזור הארוז ב - D. אתרי התחלת שעתוק Zfh1 ו-mRNA יחיד מסומנים על ידי חצים וראשי חץ, בהתאמה. צביעת DAPI (כחול). פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A,B,A',B'), 10 מיקרומטר (A",B",C,D), 5 מיקרומטר (C',D'). קיצורים: IFMs = שרירי טיסה עקיפים; smFISH = RNA פלואורסצנטי של מולקולה אחת באתרו ; AMPs = אבות שרירים בוגרים; MuSCs = תאי גזע שריר; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65713/65713fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65713/65713fig3v2.jpg"> איור 3: כימות של שעתוק Mef2 והצטברות mRNA ציטופלזמי על-ידי smFISH. (A) התפלגות תעתיקי Mef2 (סגול) וחלבון Mef2 (ירוק) ב-IFMs בוגרים מסוג בר. (א') הגדלה גבוהה יותר של אזור הקופסה ב- A. אתרי התחלת שעתוק ו-mRNA בודדים מסומנים על ידי חצים וראשי חץ, בהתאמה. (ב,ג) איתור אוטומטי של נקודות Mef2 וסגמנטציה גרעינית. mRNA ציטופלזמי וגרעיני Mef2 מסומנים בירוק ובמגנטה, בהתאמה. (ב', ג') הגדלות גבוהות יותר של אזורים ארוזים ב- B ו - C. כוכביות מציינות כתמים שאינם נספרים במאקרו. (D) דוגמה לכימות נקודתי Mef2 ב-AMPs וב-IFM בוגרים, ביחס למספר הכולל של גרעינים. (p = 0,0785, מבחן t של תלמיד, דיסקיות כנף (n = 4), IFMs (n = 11)). (E) דוגמה לכימות התפלגות נקודתית Mef2 ב- IFM בוגרים. (*** עמ< 0.0007, מבחן t של סטודנט, n = 5). (F) אחוז כתמי Mef2 mRNA שזוהו בתוך הגרעינים ומחוצה להם (n = 5). פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר (A,A'). קיצורים: IFMs = שרירי טיסה עקיפים; smFISH = RNA פלואורסצנטי של מולקולה אחת באתרו ; AMPs = אבות שרירים בוגרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65713/65713fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: מאקרו המשמש לעיבוד לאחר מכן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65713/Le%20Roux%20et%20al-Macro.txt" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating mRNA Spatial Distribution in Drosophila Muscle Tissue at JoVE.com

דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

בצוות שלנו חקרנו את המנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים בהתפתחות השרירים ובשיקומם. למעשה, הפיזור המיוחד של מולקולות mRNA ידוע כמווסת תהליכים תאיים שונים. וכאן, אנו משתמשים בדרוזופילה כמודל לחקור כיצד ה-mRNA מפוזרים במיוחד בתוך רקמת השריר של הזבוב.דינמיקת ביטוי גנים הוכחה כמווסתת תהליכים ביולוגיים שונים של שרירים. הופעתן של טכניקות ריצוף RNA של תא בודד וגרעינים בודדים בתפוקה גבוהה אפשרה חקירה מקיפה של דינמיקת השעתוק. מגבלה בולטת אחת של טכניקות האומיקס הקלאסיות היא חוסר היכולת לספק את הפיזור המרחבי של מולקולות mRNA בתוך סיבי השריר של דרוזופילה.תכונה זו יכולה להיחקר על ידי הכלאה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת באתרה. השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע את דינמיקת השעתוק mRNA ואת הפיזור המרחבי בתוך מערכת השרירים דרוזופילה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטה לזיהוי וקודיפיקציה של מולקולות mRNA בודדות בסיבי שריר דרוזופילה בעלי רזולוציה מרחבית גבוהה וסולמות מולקולות אותות.אתגר עכשווי בתחום הוא לדמיין את דינמיקת התחדשות השרירים בזמן אמת ובבעלי חיים חיים. לכן אנו מנסים לפתח גישת הדמיה חיה כדי לדמיין את התנהגות תאי גזע השריר בסביבתם הטבעית, וגם להתייחס לשאלת אופן וטווח הנדידה שלהם, למשל, במהלך התחדשות השרירים וגם התמיינות שלהם וזאת ברזולוציה חסרת תקדים.

studying-muscle-transcriptional-dynamics-at-single-molecule-scales

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

816 Views.  UMR6290 CNRS - Université de Rennes. בצוות שלנו חקרנו את המנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים בהתפתחות השרירים ובשיקומם. למעשה, הפיזור המיוחד של מולקולות mRNA ידוע כמווסת תהליכים תאיים שונים. וכאן, אנו משתמשים בדרוזופילה כמודל לחקור כיצד ה-mRNA מפוזרים במיוחד בתוך רקמת השריר של הזבוב.דינמיקת ביטוי גנים הוכ?...

Video: מחבר זרקור: חקירת התפלגות מרחבית mRNA ברקמת שריר דרוזופילה 

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

Dissection and Preparation of Wing Discs and Adult Muscles from Drosophila for Single-Molecule RNA Fluorescence In Situ Hybridization

Dissection and Preparation of Wing Discs and Adult Muscles from  Drosophila  for Single-Molecule RNA Fluorescence In Situ Hybridization   

To begin, rinse the L3 stage Drosophila larvae thrice for five minutes each in cold PBS. Using two pairs of sharp forceps, hold the anterior part of the larvae and remove approximately 2/3 of the body tissues. Hold the first 1/3 of the larvae with one pair of forceps and mouth hooks with the other pair.Then retract the mouth hooks inside the larvae until the larvae is fully inverted. Remove the leg discs and brain to obtain a clean inverted larval carcass with a pair of wing discs attached to the trachea. Transfer the wing discs into a one-milliliter centrifuge tube.Fix the wing discs in 4%paraformaldehyde diluted in PBS for 45 minutes at room temperature under agitation. After fixation, wash the samples thrice for five minutes each with 70%ethanol. Remove the heads, abdomens, legs, and wings from the anesthetized flies and place the dissected thoraxes in cold PBS.Prefix the thorax in 4%paraformaldehyde diluted in 1%Triton for 20 minutes under agitation. Then wash the samples thrice for five minutes each using PBT under agitation. Position the thoraxes on a double-sided tape on a glass slide, and bisect them using a sharp microtome blade to produce two hemithoraces.Fix the hemithoraces in 4%paraformaldehyde for 45 minutes under agitation. Wash the samples twice for 20 minutes each using PBT under agitation. Place the hemithoraces in cold PBS and use forceps to carefully isolate the indirect flight muscles from the hemithoraces.Permeabilize the muscles in 70%ethanol for two to seven days at four degrees Celsius. After permeabilization, wash the IFMs twice for 20 minutes each using buffer A.Then add 400 microliters of the hybridization buffer and pre-hybridize the muscles for 30 minutes at 37 degrees Celsius in a thermal mixer. Add 100 microliters of freshly prepared hybridization buffer containing the probe and the primary antibody.Incubate the samples in the dark at 37 degrees Celsius for 16 hours at 300 RPM in a thermal mixer. After incubation, wash the samples thrice using warm buffer A for 10 minutes each. Then incubate the samples in secondary antibody and DAPI diluted in buffer A at 37 degrees Celsius for one hour.Wash the samples thrice with buffer B for 20 minutes each before transferring them onto a microscope slide. Wipe off the residual buffer B and add 30 microliters of mounting medium onto the slide. Place an 18-by-18 millimeter cover slip onto the slide and sealed the cover slip using nail polish.

דיסקציה והכנה של דיסקיות כנף ושרירים בוגרים מדרוזופילה להכלאה פלואורסצנטית של RNA במולקולה בודדת באתרו

Confocal Imaging and Quantitative Analysis of smFISH in Wing Discs and Adult Muscles

After turning on the confocal microscope equipped with 40x and 63x oil immersion objectives, place the slide on the microscope stage. To image the wing disc associated muscle progenitors and indirect flight muscles or IFMs, set DAPI with an excitation of 405 and emission of 450 nanometers. Then select Alexa Fluor 488 with an excitation of 496 and emission of 519 nanometers, and Quasar 670 for the smFISH probes with an excitation of 647 and emission of 670 nanometers.Locate the sample using a DAPI signal and UV lamp. Save the captured images as TIFF files. To image the adult muscle stem cells, set the excitation and emission wavelengths for DAPI and Alexa Fluor 488 as demonstrated previously.Then set the wavelengths for Alexa Fluor 555 and Quasar 670 for the smFISH probes. Locate the sample and save the captured images as TIFF. Launch image J and navigate to the plugins menu.Select Macros, then Edit to open the macros source code. To quantify Mef2 smFISH spots in larvae, set the log radius to three and log quality to 20. Then segment Mef2 positive nuclei with a blur of two, a nucleus scale parameter of 30, nucleus threshold of minus eight, and nucleus size of 300.Initiate the macro by executing the run command. The macro will automatically load all images from the designated folder and quantify them sequentially. In muscle fibers, set the log radius to 2.5, log quality to 60, blur to two, nucleus scale parameter to 100, nucleus threshold to zero, and nucleus size to 300.Initiate the macro by executing the run command. The macro will automatically load all images from the designated folder and quantify them sequentially. After analysis, check the results displayed in file FISH results and file nuclei results.The Mef2 and Zfh1 transcripts were uniformly detected in the AMP population and colocalized with Mef2 and Zfh1 proteins respectively. A higher magnification of AMPs distinguished between transcription sites foci and mature mRNA scattered in the cytoplasm. Similarly, the transcription site and distribution of Mef2 and Zfh1 mRNA were examined in differentiated adult IFMs and associated stem cells.The in-house built image J macro effectively detected and segmented Mef2 spots and muscle nuclei. The quantitative analysis of Mef2 mRNA per nuclei in adult IFMs and the AMPs were not significantly different. The quantification of Mef2 spot distribution showed that 92%of Mef2 mRNA is present in the cytoplasm, and 8%are associated with muscle nuclei.