עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד לבריאות ומחקר רפואי המועצה של אוסטרליה (NHMRC) (526615 ו - 545906) ו בין השאר על ידי תוכנית של ממשלת ויקטוריאני OIS. DS הוא בחור של NHMRC.

1. הכנת [3 H] כולסטרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונה קטר, לוותר על הסכום הנדרש של כולסטרול [3 H] לתוך צינור microfuge 1.5 מ&quot;ל (0.5 μCi (19 kBq) לכל גם נדרש assay אופייני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם [3 H]-כולסטרול הוא תלוי טולואן, לייבש אותו לחלוטין עם גז N2 ו resuspend אתנול עם 100% ריכוז סופי של 1 μCi (37 kBq / μl. וורטקס ומערבבים היטב. </li></ol> 2. ציפוי תאים וסימון כולסטרול נייד פרוטוקול זה נבדק באמצעות סוגי תאים הבאים: ומונוציטים האדם, 4.5 THP-1 אדם מונוציטים למוצרי ומקרופגים 6,7,8, גלם 264.7 ומקרופגים Murine 5,9,10,11, תאים הלה 12, וריד הטבור האדם אנדותל תאים (HUVEC), BHK-21 תאים 9, fibroblasts אדם ועכבר 13,14, HepG2 תאים hepatocarcinoma אדם 15 ו, בצורה שונה, החל טסיות &lt;sup&gt; 16. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים ולספור אותם. התאים לתוך צלחת של 12 צלחות גם בצפיפות הסופי של 0.2x10 6 תאים בכל טוב בינוני 0.9 מ&quot;ל מלאה. תאים ימשיך לגדול ויגיע 0.8x10 6 תאים לכל גם כאשר הניסוי בזרימת. עבור תאים שאינם מתחלקים, כמו הבדיל THP-1 תאים, צפיפות זריעה צריך להיות 0.8x10 6 תאים לכל טוב. אם באמצעות 6 - או 24 גם צלחות, כפול או חצי את מספר התאים בכל טוב בהתאמה. מספר בארות צריך להיות מספיק קביעות ארבע פעמים עבור כל תנאי הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הבידול של THP-1 התאים נדרשת, להוסיף PMA (הריכוז הסופי 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לתקשורת של 48-72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף aliquot קטנה של מדיה לתוך צינור המכיל microfuge [3 H] כולסטרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצדדים של הצינור עם התקשורת לפני הוספת [3 H] כולסטרול לתוך aliquot נפרד של אמצעי התקשורת מלאים (100 μl / טוב). </li> &lt;li&gt; הוסף התקשורת המכילים [3 H] הכולסטרול על בארות עם תאים (נפח סופי לכל גם הוא 1 מ&quot;ל). אם אין טיפול בתאי נדרש לפני תיוג, תאים ניתן מצופה ב [3 H] בינוני כולסטרול המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 48 שעות בתרבית תאים בחממה (37 ° C, CO 5% 2). </li></ol> 3. איזון דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 48 שעות, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ. לוודא שהם בריאים הם במפגש כ 80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה המכילה [3 H] כולסטרול. לשטוף את התאים בעדינות עם PBS. לחזור 3 פעמים כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין סרום ללא התקשורת. במידת הצורך, להפעיל את התאים על ידי הוספת אגוניסט LXR (כגון, 901317 ב 1-4 mmol / L) או מחנה (0.3 μMol / L, עבור תאים ממוצא העכבר בלבד) כדי בסרום חופשי בתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl מדיה חופשיים בסרום היטב כל אחד מהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 18 שעות תרבית תאים בחממה (37 ° C, CO 5% 2). </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. בזרימת כולסטרול דגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 18 שעות במדיום סרום חינם, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ. לוודא שהם בריאים confluent (מינימום 80% confluency). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של acceptors בזרימת הכולסטרול בדם ללא בינוני. דוגמאות acceptors כוללים: אפוליפופרוטאין AI (apoA-I) (הריכוז הסופי 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) (הריכוז הסופי 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל) Cyclodextrin (הריכוז הסופי 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל) פלזמה (הריכוז הסופי 1-2%) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של סרום ללא מדיה עם acceptors היטב כל אחד מהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעזוב קבוצה אחת של בארות כדי לקבוע רקע בזרימת (בזרימת התקשורת חופשיים בסרום עם acceptor NO) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עבור 2 שעות תרבית תאים אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). משך הדגירה בזרימת עשוי לנוע בין 30 דקות ועד 8 שעות לפי הצורך. </li></ol> 5. עיבוד שאmples <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שעות הדגירה לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מדיה לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל microfuge. ספין ב -14,000 סל&quot;ד 1-10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר Media 100 μl לתוך בקבוקון מ&quot;ל 7 נצנץ. הוסף 5 MLS של Insta-ג&#39;ל פלוס (PerkinElmer) תערובת מערבולת. לאחסן דגימות הנותרים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחות במקפיא למשך 30 דקות. הוסף 500 μl DH 2 O היטב כל אחד מהם. לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ על מנת להבטיח כי כל התאים נוקף מעומק בארות. אם חסיד עדיין, או לעזוב את הצלחות עם DH 2 O על 4 מעלות צלזיוס בארות לילה או גירוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כל התאים לא המריא, פיפטה למעלה ולמטה כדי לפרק את גושי תאים. העברת 100 μl לתוך צלוחיות 7 מ&quot;ל נצנץ. הוסף 5 MLS של Insta-ג&#39;ל פלוס (PerkinElmer) תערובת מערבולת. אחסן את לוחות הנותרים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלוחיות נצנץ על מונה נצנץ. להגדיר מונה לספור על [3 H] בDPM יחידות. </li></ol> 6. ניתוח תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיעור בזרימת הכולסטרול בא לידי ביטוי בדרך כלל שיעור הכולסטרול עבר התאים acceptor. הנוסחה הבאה נעשה שימוש: </li></ol><img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq1.jpg" /><ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזרימת מסוימת מחושב כהפרש בין בזרימת בנוכחות או העדר acceptor (ריק). </li></ol><img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq2.jpg" /> 7. ציר הזמן <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810timeline.jpg" /> 8. נציג תוצאות דוגמה לתוצאות של ניסוי בזרימת כולסטרול מוצג איור. 1. בניסוי זה THP-1 מונוציטים אדם היו מובחנים אל מקרופאגים ו בזרימת הכולסטרול acceptors שונים היהנבדק. בזרימת כולסטרול עד בינוני ללא acceptors (&quot;ריק&quot;) היה 0.79% ואת ערך זה נחשב בזרימת שאינו ספציפי והיה מפחיתים את הערכים האחרים. בזרימת כולסטרול לאדם apoA-I (הריכוז הסופי 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל) היה 4.75%. מדגם פלזמה התייחסות נכלל לתוך הניסוי הזה כדי לפקח בין הניסוי השונות. מדגם התייחסות יכול לשמש נורמליזציה של נתונים על פני מספר רב של ניסויים, אבל מצאנו שנכון לחזור assay אם השונות היא גבוהה. פלזמה החולה (הריכוז הסופי 2%) נבדקה לפני ואחרי החולה קיבל טיפול תרופתי. הוא הגיע למסקנה כי התרופה לחולה הייתה השפעה שלילית על היכולת של פלזמה לתמוך בזרימת כולסטרול. דוגמה נוספת של תוצאות הניסוי בזרימת מוצג איור. 2. בניסוי זה הגלם 264.7 מקרופאגים הופעלו או לא יופעלו על ידי הדגירה לילה עם אגוניסט LXR TO-901317 (הריכוז הסופי1 μmol / L) בזרימת כולסטרול מדגם זהה של פלסמה אנושית (2%) נבדק. הוא הגיע למסקנה כי הפעלת ביטוי הסלולר של רשת ABC עם מובילי אגוניסט LXR מגביר את היכולת של התאים לשחרר את הכולסטרול acceptor תאיים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig1.jpg" /> באיור 1. בזרימת כולסטרול מן THP-1 תאים acceptors שונים. אחוז בזרימת כולסטרול (דהיינו, את שיעור הכולסטרול שכותרתו עבר התאים acceptor הוגדר) מוצגת לאחר ניכוי המקרים של ערכים ריקים. ממוצע ± סטיית תקן של קביעות ארבע פעמים, * p &lt;0.05. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig2.jpg" /> איור 2. בזרימת כולסטרול מ 264.7 אחוז מופעל או לא מופעל עם אגוניסט LXR כדי פלזמה האדם. RAW של בזרימת כולסטרול (דהיינו, את שיעור הכולסטרול שכותרתו עבר התאיםacceptor המצוין) מוצגת לאחר ניכוי המקרים של ערכים ריקים. ממוצע ± סטיית תקן של קביעות ארבע פעמים, * p &lt;0.001.

<ol>
	<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+in+health+and+disease.">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+feedback:+from+Schoenheimer's+bottle+to+Scap's+MELADL.">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation:+basic+concepts+and+physiological+implications.">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li><li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response.">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li><li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages.">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li><li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li><li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+reconstituted+high-density+lipoprotein+leads+to+acute+changes+in+human+atherosclerotic+plaque.">Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque.</a> Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).</li><li>Kekulawala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+freezing+on+high-density+lipoprotein+functionality.">Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality.</a> Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).</li><li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure/Function+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides:+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein.">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li><li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport.">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li><li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo.">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li><li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux.">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li><li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+(caveolae.">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li><li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis.">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li><li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells.">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li><li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li></ol>

החוקרים מצהירים שום אינטרסים מנוגדים הקשורים במחקר זה.

השיטה המתוארת למדוד בזרימת כולסטרול נועד למדוד את התנועה של כולסטרול מן התאים acceptor כולסטרול תאי. ישנם שיקולים קריטיים מספר בהבנה זו מתודולוגיה. Labelling ועל איזון המתודולוגיה המתוארת כולסטרול שכ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים \ תאים </td><td> הלה </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> השלם מדיה </td><td colspan="3"> RPMI - 10% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td><td> M199 - 5% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 1% סטרפטוקוקוס HEPES - 2% (1M) - 7% תוספת צמיחה תא האנדותל (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 10% FCS - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td></tr><tr><td> חינם מדיה בסרום </td><td colspan="3"> RPMI - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td><td> M199 - 1% L-גלוטמין - עט 1% סטרפטוקוקוס HEPES - 2% (1M) - תא האנדותל 7% לגדולה תוספת (ECGS) </td><td colspan="2"> DMEM - 1% L-גלוטמין - עט 0.2% סטרפטוקוקוס </td></tr><tr><td> מעבר שיטה </td><td> 1 x טריפסין </td><td> השעיה </td><td> לגרד </td><td colspan="3"> 1 x טריפסין </td></tr><tr><td> מעבר יחס </td><td> 3:10 </td><td> 01:03 </td><td></td><td> 1:20 </td><td> 01:03 </td><td> 01:03 </td></tr><tr><td> הפעלת התא (לא חובה) </td><td></td><td colspan="5"> TO-901317 - LXR-אגוניסט - גמר קונצרט כלשהו. 4 מיקרומטר </td></tr><tr><td> אחרים ריאגנטים </td><td></td><td> phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA) - תא התמיינות - גמר קונצרט כלשהו. 0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterol efflux assay

תוכן כולסטרול בתאי יש לשמור בגבולות צרים מאוד, יותר מדי או מעט מדי כולסטרול בעוד כמה תוצאות תאים שיבוש של ממברנות הסלולר, אפופטוזיס ו נמק 1. תאים יכולים כולסטרול המקור סינתזה תאיים וממנה ליפופרוטאינים פלזמה, שני מקורות מספיקים כדי לספק את הדרישות באופן מלא של תאים כולסטרול. תהליכים של סינתזה ספיגת כולסטרול מוסדרים בחוזקה ליקויים של כולסטרול הן 2 נדיר. כולסטרול מופרזת היא בעיה נפוצה יותר 3. למעט hepatocytes וכן כמה תאים תואר adrenocortical, התאים אינם יכולים לבזות כולסטרול. לתאים יש שתי אפשרויות להפחתת כולסטרול התוכן שלהם: להמיר כולסטרול לתוך אסטרים cholesteryl, אופציה עם קיבולת מוגבלת כמו עומס יתר התאים עם אסטרים cholesteryl הוא גם רעיל, בזרימת כולסטרול, אפשרות בלתי מוגבלת עם יכולת פוטנציאלית. בזרימת כולסטרול הוא מפרטתהליך ific זה מוסדר על ידי מספר מובילי תאיים, כגון ה-ATP מחייב טרנספורטר קלטת חלבונים A1 (ABCA1) ו - G1 (ABCG1) ו הקולטן נבלות B1 סוג. Acceptor טבעי של כולסטרול בפלסמה הוא ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) אפוליפופרוטאין AI. Assay בזרימת כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית. הוא מודד את היכולת של התאים לשמור בזרימת כולסטרול ו / או את היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay מורכב מהשלבים הבאים. שלב 1: תיוג כולסטרול הסלולר באמצעות הוספת כולסטרול שכותרתו עד בינוני סרום המכיל ו דוגרים עם תאים של 24-48 שעות. צעד זה עשוי להיות משולב עם הטעינה של תאים עם כולסטרול. שלב 2: הדגירה של תאים בינוניים סרום ללא כולסטרול כדי לאזן בין כל שכותרתו בריכות כולסטרול תאיים. שלב זה עשוי להיות משולב עם הפעלת הסלולר CHolesterol מובילי. שלב 3: הדגירה של תאים עם acceptor תאי ו quantitation התנועה של כולסטרול שכותרתו מתאי כדי acceptor. אם מבשרי כולסטרול שימשו לתייג כולסטרול מסונתז החדש, שלב 1/4, טיהור של כולסטרול, ייתכן שיהיה צורך. Assay מספק את הפרטים הבאים: (א) כיצד טיפול מסוים (מוטציה, דפיקה למטה, ביטוי יתר או טיפול) משפיע על היכולת של התא כולסטרול בזרימת ו (ב) עד כמה את היכולת של acceptors פלזמה לקבל את הכולסטרול נגוע במחלה או טיפול. שיטה זו משמשת לעתים קרובות בהקשר של המחקר לב וכלי דם, הפרעות מטבוליות ו ניווניות, מחלות זיהומיות הרבייה.

Watch this Scientific Journal Video about Cholesterol Efflux Assay at JoVE.com

בדיקת שפע כולסטרול | רפואה | וִידֵאוֹ

Cholesterol Efflux Assay

Assay כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית ואת היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay כולל תיוג תאים עם איזון כולסטרול, הכולסטרול בין בריכות תאיים ושחרור של כולסטרול כדי acceptor תאיים.

בזרימת כולסטרול Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Medicine

Fundamentals

Chemistry of Life

SCIENTISTS IN ACTION

29.5K Views.  Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Assay כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית ואת היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay כולל תיוג תאים עם איזון כולסטרול, הכולסטרול בין בריכות תאיים ושחרור של כולסטרול כדי acceptor תאיים.

Video: Cholesterol Efflux Assay

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

גרורה ניסויית Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
contractions. The pelvic limb of an anesthetized dog is immobilized in a stereotactic frame to align the tibia at a right angle to the femur. Adhesive wrap affixes the 
paw to a pedal mounted on the shaft of a servomotor to measure torque. Percutaneous nerve stimulation activates pelvic limb muscles of the paw to either push (extend) or 
pull (flex) against the pedal to generate isometric torque. Percutaneous tibial nerve stimulation activates tibiotarsal extensor muscles. Repeated eccentric (lengthening) 
contractions are induced in the tibiotarsal flexor muscles by percutaneous peroneal nerve stimulation. The eccentric protocol consists of an initial isometric contraction 
followed by a forced stretch imposed by the servomotor. The rotation effectively lengthens the muscle while it contracts, e.g., an eccentric contraction. During 
stimulation flexor muscles are subjected to an 800 msec isometric and 200 msec eccentric contraction. This procedure is repeated every 5 sec. To avoid fatigue, 4 min rest 
follows every 10 contractions with a total of 30 contractions performed.

In Vivo Canine Muscle Function Assay

We describe a minimally-invasive and painless method to measure canine hindlimb muscle strength and muscle response to repeated eccentric contractions.

In vivo Assay שרירים כלב פונקציה

We describe a minimally-invasive and reproducible method to measure canine pelvic limb muscle strength and muscle response to repeated eccentric 
...

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

במודל עכבר של Assay את הקרנית Pocket לחקר אנגיוגנזה

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

<em&gt; באוב</em&gt; CAM-assay כXenograftmodel לסרקומה

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

הדמיית הלבלב Neuroplasticity:<em&gt; במבחנה</em&gt; Dual-נוירון פלסטיות Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

דיפרנציאלית השפעות תרופות להורדת שומנים בדם להתכוונן מורפולוגיה של כולסטרול חלקיקים

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.