אנו מודים לד"ר דניאל הייזנלדר על עזרתו בבדיקת שיטות שונות לדילול דם. בדיקות הורמונים בסרום בוצעו במרכז לחקר הרבייה של אוניברסיטת וירג'יניה, Ligand Assay and Analysis Core, בתמיכת יוניס קנדי שרייבר NICHD Grant R24 HD102061. מרכז הפנוטיפינג המטבולי של עכבר מישיגן - Live נתמך על ידי מרכז NIH Grant U2C DK135066. JF ו- NQ נתמכים על ידי מענקי DK020572 (MDRC) ו- DK089503 (MNORC). CFE ו- CSM נתמכים על ידי מענק NICHD R21 HD109485 ו- R01 HD096324.

טכנולוגיית DREADDs ודגימת דם אוטומטית

<ol>
	<li>Kokoris, G. J., Lam, N. Y., Ferin, M., Silverman, A. J., Gibson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+promote+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+congenitally+hypogonadal+(hpg)+male+mice.">Transplanted gonadotropin-releasing hormone neurons promote pulsatile luteinizing hormone secretion in congenitally hypogonadal (hpg) male mice.</a> Neuroendocrinology. 48 (1), 45-52 (1988).</li><li>Coquelin, A., Desjardins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luteinizing+hormone+and+testosterone+in+young+and+old+male+mice.">Luteinizing hormone and testosterone in young and old male mice.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 243 (3), E257-E263 (1982).</li><li>Carmel, P. W., Araki, S., Ferin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+stalk+portal+blood+collection+in+rhesus+monkeys:+Evidence+for+pulsatile+release+of+gonadotropin-releasing+hormone+(GnRH).">Pituitary stalk portal blood collection in rhesus monkeys: Evidence for pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH).</a> Endocrinology. 99 (1), 243-248 (1976).</li><li>Schuiling, G., Gnodde, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site+of+origin+of+the+pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone+in+long-term+ovariectomized+rats.">Site of origin of the pulsatile secretion of luteinizing hormone in long-term ovariectomized rats.</a> Journal of Endocrinology. 70 (1), 97-104 (1976).</li><li>Hackwell, E. C. R., Ladyman, S. R., Brown, R. S. E., Grattan, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+lactation-induced+infertility+in+female+mice.">Mechanisms of lactation-induced infertility in female mice.</a> Endocrinology. 164 (5), 1-12 (2023).</li><li>Bahougne, T., Kretz, M., Angelopoulou, E., Jeandidier, N., Simonneaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+circadian+disruption+on+female+mice+reproductive+function.">Impact of circadian disruption on female mice reproductive function.</a> Endocrinology. 161 (4), (2020).</li><li>Kreisman, M. J., McCosh, R. B., Tian, K., Song, C. I., Breen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+Enables+Chronic+Corticosterone+to+Inhibit+Pulsatile+Luteinizing+Hormone+Secretion+and+Suppress+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice.">Estradiol Enables Chronic Corticosterone to Inhibit Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion and Suppress Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Neuroendocrinology. 110 (6), 501-516 (2020).</li><li>Moenter, S. M., Evans, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotropin-releasing+hormone+GnRH+measurements+in+pituitary+portal+blood.">Gonadotropin-releasing hormone GnRH measurements in pituitary portal blood.</a> Journal of Neuroendocrinology. 34 (5), 13065 (2022).</li><li>Maeda, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+LHRH+pulse+generator:+A+mediobasal+hypothalamic+location.">The LHRH pulse generator: A mediobasal hypothalamic location.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 19 (3), 427-437 (1995).</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice.">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice.">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li><li>Minabe, S., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pulsatile+and+surge-like+luteinizing+hormone+secretion+with+frequent+blood+sampling+in+female+mice.">Analysis of pulsatile and surge-like luteinizing hormone secretion with frequent blood sampling in female mice.</a> Journal of Reproduction and Development. 57 (5), 660-664 (2011).</li><li>Perreau-Lenz, S., Kalsbeek, A., P&#233;vet, P., Buijs, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+clock+output+stimulates+melatonin+synthesis+at+night.">Glutamatergic clock output stimulates melatonin synthesis at night.</a> European Journal of Neuroscience. 19 (2), 318-324 (2004).</li><li>Herwig, A., P&#233;vet, P., Bothorel, B., Steinlechner, S., Saboureau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-pineal+microdialysis+in+the+Djungarian+hamster+(Phodopus+sungorus):+A+tool+to+study+seasonal+changes+of+circadian+clock+activities.">Trans-pineal microdialysis in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): A tool to study seasonal changes of circadian clock activities.</a> Journal of Pineal Research. 40 (2), 177-183 (2006).</li><li>Adams, J. M., Otero-Corchon, V., Hammond, G. L., Veldhuis, J. D., Qi, N., Low, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatostatin+is+essential+for+the+sexual+dimorphism+of+GH+secretion,+corticosteroid-binding+globulin+production,+and+corticosterone+levels+in+mice.">Somatostatin is essential for the sexual dimorphism of GH secretion, corticosteroid-binding globulin production, and corticosterone levels in mice.</a> Endocrinology. 156 (3), 1052-1065 (2015).</li><li>Alexander, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+in+transgenic+mice+expressing+evolved+G+protein-coupled+receptors.">Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors.</a> Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).</li><li>Krashes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=reversible+activation+of+AgRP+neurons+drives+feeding+behavior+in+mice.">reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Eighth+edition.">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eighth edition.</a> National Research Council. , (2011).</li><li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperinsulinemic-euglycemic+clamps+in+conscious,+unrestrained+mice.">Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3188 (2011).</li><li>Peters, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+ABS+Part+I:+Introduction+to+automated+blood+sampling.">Culex ABS Part I: Introduction to automated blood sampling.</a> Current Separations. 18 (4), 139-145 (2000).</li><li>Bohs, C., Cregor, M., Gunaratna, G., Kissinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+Automated+blood+sampler+part+II+Managing+freely-moving+animals+and+monitoring+their+activity.">Culex Automated blood sampler part II Managing freely-moving animals and monitoring their activity.</a> Current Separations. 18 (4), 147-151 (2000).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Kreisman, M. J., Mccosh, R. B., Breen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+ultra-sensitive+ELISA+for+measurement+of+LH+in+mice.">A Modified ultra-sensitive ELISA for measurement of LH in mice.</a> Endocrinology. 163 (9), (2022).</li><li>Pielecka-Fortuna, J., Chu, Z., Moenter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kisspeptin+acts+directly+and+indirectly+to+increase+gonadotropin-releasing+hormone+neuron+activity+and+its+effects+are+modulated+by+estradiol.">Kisspeptin acts directly and indirectly to increase gonadotropin-releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by estradiol.</a> Endocrinology. 149 (4), 1979-1986 (2008).</li><li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+subpopulations+of+kisspeptin+neurons+communicate+with+GnRH+neurons+in+female+mice.">Specialized subpopulations of kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in female mice.</a> Endocrinology. 156 (1), 32-38 (2015).</li><li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+reproductive+status/stages+in+mice.">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 1-8 (2009).</li><li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse+and+surge+profiles+of+luteinizing+hormone+secretion+in+the+mouse.">Pulse and surge profiles of luteinizing hormone secretion in the mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+the+different+roles+of+hypothalamic+kisspeptin+neurons+in+regulating+female+reproduction.">Genetic dissection of the different roles of hypothalamic kisspeptin neurons in regulating female reproduction.</a> eLife. 8, 43999 (2019).</li><li>McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequent+tail-tip+blood+sampling+in+mice+for+the+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion.">Frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57894 (2018).</li><li>Vanacker, C., Defazio, R. A., Sykes, C. M., Moenter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+glial+fibrillary+acidic+protein+(Gfap)-expressing+cells+in+the+regulation+of+gonadotropin-releasing+hormone+(GnRH)+but+not+arcuate+kisspeptin+neuron+output+in+male+mice.">A role for glial fibrillary acidic protein (Gfap)-expressing cells in the regulation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) but not arcuate kisspeptin neuron output in male mice.</a> eLife. 10, e68205 (2021).</li><li>Dulka, E. A., Defazio, R. A., Moenter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemogenetic+suppression+of+GnRH+neurons+during+pubertal+development+can+alter+adult+GnRH+neuron+firing+rate+and+reproductive+parameters+in+female+mice.">Chemogenetic suppression of GnRH neurons during pubertal development can alter adult GnRH neuron firing rate and reproductive parameters in female mice.</a> eNeuro. 7 (3), 0223 (2020).</li><li>Talbi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Action+of+Tachykinin+Signaling+on+Pulsatile+LH+Secretion+in+Male+Mice.">Characterization of the Action of Tachykinin Signaling on Pulsatile LH Secretion in Male Mice.</a> Endocrinology. 162 (8), 1-9 (2021).</li><li>Tuli, J., Smith, J., Morton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone,+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding,+and+its+effect+on+nearby+animals.">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animals. 29 (1), 90-95 (1995).</li><li>Lucien, J. N., Ortega, M. T., Shaw, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+and+puberty.">Sleep and puberty.</a> Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 17, 1-7 (2021).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

באמצעות פרוטוקול זה הצלחנו להראות פעימות LH בסיסיות והפרשת LH לאחר גירוי של אוכלוסייה עצבית. היתרונות הגדולים של המערכת הם הסביבה נטולת הלחצים בה מתבצעת הדגימה, ללא נוכחות או טיפול אנושי במהלך דגימת הדם. בנוסף, לא נדרשו אילוף מייגע קודם של בעלי חיים והסתגלות לנוכחות או לטיפול אנושי במהלך הניסוי. ניסויים קודמים באמצעות דגימת דם ידנית דרשו כמות גדולה של זמן ומאמץ כדי למזער את גורמי הלחץ 7,31,32. עם זאת, חיתוך הזנב לבדו הוא גורם לחץ33. יישום פרדיגמת סביבה לא מלחיצה ופרדיגמת אילוף במתקני בעלי חיים משותפים, שבהם הפרעות הן בלתי צפויות, עשוי גם הוא להיות אילוץ. במעבדות מסוימות, בעלי חיים לעתים קרובות צריך להיות מועבר לחדרי הליך חלופיים עבור דגימת דם. מגבלות אלה עשויות להפוך את השיטה הידנית ללא מתאימה לזיהוי שינויים עדינים ברמות LH, ולכן, גישה מעשית יכולה להיות מועילה במצבים אלה. הדגימה האוטומטית מתבצעת בחדר שקט שבו מניחים את העכברים מספר ימים מראש כדי להתאקלם בסביבה החדשה. הניסיון הקודם שלנו עם פרוטוקול זה סיפק זיהוי מדויק של דפוסי הפרשת קורטיקוסטרון והורמון גדילה פולסטילי בעכברים, ולא הראה רמות גבוהות של קורטיקוסטרון במהלך הדגימה האוטומטית15. בניסויים הנוכחיים, כל החיות הותאמו היטב למערכת הדגימה שהראתה בניית קן בתא הדגימה לאחר ~24 שעות וצבע שיער בהיר, מה שמצביע על היעדר סטרס ומצב בריאותי כללי טוב (איור 1).
הקושי העיקרי המוביל לתוצאות שליליות הוא כנראה מיקוד לא מתאים של AAV לאוכלוסייה העצבית הנדרשת. דיוק בזריקות הסטריאוטקסיות הוא חיוני ויש לבצע אימון מראש כדי לוודא את הקואורדינטות ואת נפחי ההזרקה. אימון יכול להיעשות על ידי הזרקת כמות קטנה של 0.5-1% אוונס כחול למיקום הרצוי בניתוח ללא התאוששות ולאחר מכן לקחת פרוסה של המוח שזה עתה נותח באמצעות מטריצת מוח עכבר (למשל, טד פלה) כדי לבדוק את האתר ואת גודל הזריקה באמצעות סטריאוסקופ.
חשוב גם לקחת בחשבון שדם ופלזמה שנאספו ממערכת דגימת הדם האוטומטית ידוללו במי מלח הפריניזציה (למשל, 20 מיקרוליטר דם ב-50 מיקרוליטר מי מלח בתוצאות שלנו)20, וייתכן שיהיה צורך להתאים את יחס הדילול לרגישות השיטה האנליטית שנבחרה. בדקנו את רמות ה-LH בדם מלא המדולל ב-BSA-PBS (כפי שמומלץ עבור LH ELISA רגיש במיוחד)10 או במי מלח ולא מצאנו הבדלים בערכי LH. לא ניתן להשתמש בטווין במדלל מכיוון שזה יזרום למערכת הדם כדי לחלץ את הדגימות על ידי החלפת נוזלי הדגימה20. מניסיוננו, דילולים של פחות מ-1:10 נתנו תוצאות LH טובות אך מעט לא העריכו נכון את רמות ה-LH בהשוואה ל-1:3.5. זה מצביע על כך שהדילול עשוי להיות מותאם עוד יותר כדי להפחית את כמות הדם שנאסף, במידת הצורך.
חלופה לאספקת תרכובת אוטומטית היא לבצע הזרקות ידניות דרך הצנתר הוורידי. במקרה זה, החוקר נמצא לזמן קצר בחדר כדי לספק את הזריקה. עם זאת, אין מגע ישיר עם בעלי החיים או עם מגוריהם וסביבתם, ובניגוד לזריקות תוך צפקיות או תת עוריות, ההליך כולו הוא לעתים קרובות מבלי לשים לב על ידי החיה. היתרונות של הזרקה ידנית הם שאין צורך להגדיר מראש את דילול התרכובת, מה שעשוי להיות קריטי עבור תרכובות יקרות מדי לשימוש בנפחים גדולים יותר או רגישות להתכלות לאורך זמן; מכיוון שנפח הפעולה קטן יותר מאשר במשלוח אוטומטי, שם יש למלא מראש את קו העירוי והצנתר בתמיסה מורכבת יותר.
דגימת דם אוטומטית מספקת הזדמנות ייחודית לחקור וריאציות LH במהלך השינה, למשל. אנו צופים באופן קבוע בבעלי חיים ישנים בקינים שלהם בזמן הדגימה. ניתן לקשר דגימה זו עם רישומי EEG כדי ליצור ניתוח מפורט יותר של הקשר בין פעילות עצבית לבין דפוס LH34. כפי שמוצג כאן, האפשרויות לשימוש בדגימת דם אוטומטית הן רבות: החל מדגימת LH בסיסית לבדיקת תגובת LH לתרכובות אנדוגניות או אקסוגניות, או להפעלה או דיכוי של אוכלוסיות עצביות. המניפולציות העצביות יכולות להיות מיושמות בחריפות עם כימוגנטיקה או אופטוגנטיקה, או לצמיתות באמצעות מודלים של עכברים טרנסגניים וכלי השתקה אפופטוטיים או עצביים. דגימת דם אוטומטית מאפשרת גם מדידה של הורמונים אחרים בעלי דפוסי הפרשה פועמים מאוד (למשל, הורמון גדילה15). בנקבות עכברים, אם נדרש שלב מסוים של מחזור הייחום, ניתן לאסוף בזהירות מריחות נרתיקיות שעות לפני תחילת פרוטוקול26 מבלי להפריע לקווי העירוי והדגימה. בעלי חיים יכולים להיות מחוברים למערכת הדגימה למשך 7-10 ימים כאשר הסיכון לקרישת קו העורקים עולה עם הזמן.
טכניקה זו, עם זאת, מוגבלת לשימוש בבעלי חיים יחידים, ולכן, היא עשויה שלא להתאים לחקר אינטראקציות חברתיות. היא גם פולשנית ודורשת ניתוח מאתגר מבחינה טכנית, כך שייתכן שלא ניתן יהיה ליישם אותה עם חיות צעירות או מודלים מסוימים של מחלות. לבסוף, מכיוון שעלות רכישת המערכת עשויה להיות גבוהה מדי עבור מעבדת מחקר בודדת, רצוי להקים אותה במעבדת ליבה המספקת את פרוטוקול הניסוי שהוזכר כשירותים.
לסיכום, פרוטוקול זה מראה כיצד לבצע משלוח סטריאוטקסי של AAV בשילוב עם דגימת דם אוטומטית. השליטה המרחבית והזמנית המדויקת המושגת בטכניקה זו, יחד עם גמישות היישום שלה על מודלים, פרוטוקולי מדידה והורמונים שונים, הופכים אותה לשיטה רבת עוצמה לחקר הבקרה ההורמונלית במכרסמים. והכי חשוב, השיטה מספקת סביבה נטולת מתח על ידי ביטול נוכחות אנושית וטיפול במהלך הזרקה ו / או דגימה, ואילוף קודם של בעלי חיים. יתרונות אלה, יחד עם האפשרות של ריבוב, הופכים שיטה זו לכלי ייחודי לחקר הבקרה העצבית של שינויים הורמונליים בעכברים מודעים, נעים בחופשיות וללא הפרעות.

ציר ההיפותלמו-יותרת המוח-גונדל (HPG) מווסת באופן מרכזי על ידי שחרור פולסטילי של הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH) למערכת פורטל יותרת המוח. בבלוטת יותרת המוח, GnRH שולט בשחרור פולסטילי של גונדוטרופינים, הורמון luteinizing (LH), והורמון מגרה זקיק (FSH) למערכת הדם. שחרור פולסטיל LH משמש כסימן היכר לתפקוד ציר HPG מרכזי 1,2,3,4. לדוגמה, הוא מציג את ההשפעות של שינויים גנטיים או שינויים בגורמים הורמונליים או סביבתיים על החלק העצבי של ציר 5,6,7. עד לאחרונה, מדידת תבנית פולסטילית LH הייתה מוגבלת ליונקים גדולים8 וחולדות9, בהתחשב בתדירות הגבוהה של הדגימה ובנפחי הדם הגדולים הדרושים לזיהוי הפולסים.
זיהוי פולסי LH בעכברים הוא רצוי מכיוון שלמין זה יש מודלים גנטיים רחבים זמינים וניתן לתמרן אותו בקלות באמצעות טכנולוגיות הנדסה גנומית כדי להמשיך לחקור גנים ספציפיים ואוכלוסיות תאים. בעשור האחרון, התקדמות גדולה בניתוח ריכוזי LH בעכברים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים LH סנדוויץ' (ELISA) אפשרה לזהות LH בכמות זעירה של דם10. פיתוח טכניקת דגימת הדם התכופה בקצה הזנב איפשר את הדגימה התכופה הדרושה לאיתור התדירות והמשרעת של פולסי LH בעכברים10,11. עם זאת, דגימת דם בקצה הזנב מוגבלת לשימוש בו בבעלי חיים ערים בהכרה; זה דורש תקופת הכשרה ארוכה לעכברים להסתגל לטיפול ולנוכחות של חוקר ייעודי במהלך הדגימה. הצלחתו רגישה מאוד לגורמי עקה סביבתיים וייתכן שאינה מתאימה לשימוש בזני עכברים המראים רמות גבוהות של חרדה. קנולציה תוך-פרוזדורית שימשה גם לדגימת דם תכופה בעכברים מודעים הנעים בחופשיות12. עם זאת, הגדרה זו עדיין דורשת דגימת דם ידנית חוזרת ומגבילה את מרחב התנועה של בעלי החיים, בעוד קנולציה פרוזדורית יכולה להוביל לשינויים דינמיים בתפקוד הלב. לכן רצוי לבסס שיטה לאיסוף דם בתנאים נטולי לחץ בעכברים מודעים, נעים בחופשיות וללא הפרעות ללא צורך באימון מוקדם או בטיפול או נוכחות אנושית.
דגימת דם או דיאליזה אוטומטית שימשה בעבר למדידת רמות הורמונים שונות (למשל, מלטונין13,14) והפרשת הפעימות שלהם (למשל, הורמון גדילה)15 במכרסמים לא מרוסנים. אנו מציגים כאן פרוטוקול לדגימת דם אוטומטית תכופה לטווח ארוך בבעלי חיים מודעים ובלתי מרוסנים, יחד עם הפעלה מרחוק בזמן של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות באמצעות טכנולוגיות כימוגנטיות: קולטני המעצבים המופעלים באופן בלעדי על ידי סמי פיצוציות (DREADDs). נתאר את ההעברה הסטריאוטקסית של וקטור וירוס הקשור לאדנו (AAV) ואת ההפעלה מרחוק על ידי מסירה אוטומטית תוך ורידית (IV) של קלוזאפין-N-אוקסיד (CNO)16,17. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי רציף של רמות הבסיס ושינויים מושרים בפעימות LH במספר בעלי חיים בו זמנית. הן דגימת הדם והן מתן העירוי של התרכובת מתבצעות באופן מבוקר בזמן באמצעות תוכנת מחשב המבטלת את נוכחותו הפיזית של החוקר או את הדרישה לאימון עכבר קודם. שיטה זו מתגברת על המגבלות העיקריות של דגימת דם ידנית. הוא מאפשר דגימת דם במצב נטול מתח, ואספקת תרכובת עירוי בו זמנית יחד עם בקרת פעילות עצבית מרחוק. אנו מציגים תוצאות מייצגות של השימוש בדגימת דם אוטומטית לבד או בשילוב עם הפעלה עצבית מרחוק ודנים ביתרונותיה, מגבלותיה ושימושים נוספים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>44361</td>
			<td>Not necessarily this virus but this was the one used for representative results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction box</td>
			<td>Vetequip</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia induction machine</td>
			<td>Kent Scientific Equipment</td>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia masks for mice</td>
			<td>Kent Scientific Equipment</td>
			<td>SOMNO-0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip applier 9 mm</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip remover 9 mm</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclips 9 mm</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>427631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASi Culex Controller</td>
			<td>Culex</td>
			<td>SN: 2151, 2152, 2156, 2158</td>
			<td>4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASi Honey Comb Fraction Collector</td>
			<td>Honey Comb</td>
			<td>SN: 2105, 2106, 2107, 2108</td>
			<td>4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BASi Ratrun Rotation Control</td>
			<td>RATURN 2</td>
			<td>SN: 5680, 5681, 5682, 5683</td>
			<td>4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td></td>
			<td>JAX # 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clozapine-N-oxide</td>
			<td>ENZO</td>
			<td>BLM-NS105-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CULEX Automated In Vivo Sampling System</td>
			<td>BASi</td>
			<td>DS000627</td>
			<td>with CX-4000S Replacement Tubing Sets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps serrated</td>
			<td>FST</td>
			<td>11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>61100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empis control Module</td>
			<td>EMPIS CM</td>
			<td>SN: 174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empis Programmable Infusion System</td>
			<td>EMPIS</td>
			<td>SN: 2125 , 2126, 2127, 2128</td>
			<td>With CX-7010S 4 BAS-2 Infusion Sets; 4 stations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envigo 2016 diet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>low-phytoestrogen diet&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>Petrolatum Ophtalmic oinment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MIB100-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>RS-7101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine</td>
			<td>Betadine Surgical scrub</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>Fluriso</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Vaporizer or SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Surgivet or Kent Scientific Corp</td>
			<td>SS-01</td>
			<td>Anesthesia Machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) mice</td>
			<td></td>
			<td>&#160;JAX # 023436 and #024109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kisspeptin-10</td>
			<td>Phoenix Pharmaceuticals</td>
			<td>048-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-renathane tubing&#160;</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>MRE025</td>
			<td>Surgical catheterization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Holder</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;RS-7842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picoliter injector</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments&#160;</td>
			<td>P30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Warmer X2</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>FST</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-6808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>Liveo Laboratory Tubing</td>
			<td>NO.508-001</td>
			<td>0.012 in I.D x 0.025 in O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic table</td>
			<td>RWD</td>
			<td>E06208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 0.9% saline</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>2F7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile towel drapes</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades</td>
			<td>SKLAR</td>
			<td>06-3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>f-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>&#160; RS-4960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-4972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical&#160;&#160;</td>
			<td>RS-5058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cFos&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABE457</td>
			<td>Antigen target: N-terminus cFos; Host organism: Rabbit; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2631318&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1010</td>
			<td>Antigen target: recombinant GFP null; Host organism: Chicken; Dilution used: 1:10,000; RRID: AB_2307313&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Labs</td>
			<td>711-065-152</td>
			<td>Antigen target: Rabbit IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:1,000; RRID: AB_2340593&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rat IgG, AlexaFluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21209</td>
			<td>Antigen target: Rat IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2535795&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td>Antigen target: Chicken, IgY (H+L); Host organism: Goat; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2534096</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry monoclonal (16D7)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M11217</td>
			<td>Antigen target: mCherry tag; Host organism: Rat; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2536611&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

remote neuronal activation coupled with automated blood sampling to induce and measure circulating luteinizing hormone in mice

רמות הורמון luteinizing במחזור הדם (LH) הן מדד חיוני לתפקוד הבקרה ההיפותלמוסית-יותרת המוח של רבייה. תפקידם של קלטים רבים ואוכלוסיות עצביות באפנון שחרור LH עדיין אינו ידוע. מדידת שינויים ברמות LH בעכברים היא לעתים קרובות אתגר מכיוון שהם מופרעים בקלות על ידי לחץ סביבתי. הטכניקות הנוכחיות למדידת שחרור LH ופעימה דורשות הכשרה ארוכת טווח לעכברים להסתגל ללחץ מניפולציה, ריסון מסוים, נוכחות החוקר, ועבודה על בעלי חיים בודדים, מה שמקטין את התועלת שלה לשאלות מחקר רבות.
מאמר זה מציג טכניקה להפעלה מרחוק של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות באמצעות טכנולוגיית Designer Receptor Exclusivd by Designer Drugs (DREADDs) בשילוב עם דגימת דם אוטומטית רציפה בעכברים מודעים, נעים בחופשיות וללא הפרעות. ראשית אנו מתארים את פרוטוקול הניתוח הסטריאוטקסי כדי לספק וקטורים הקשורים לווירוס אדנו (AAV) המבטאים DREADDs לאוכלוסיות נוירונים ספציפיות. לאחר מכן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור קנולציה של עורק התרדמה ווריד הצוואר וחיבור לאחר ניתוח למערכת דגימת הדם האוטומטית CULEX. לבסוף, אנו מתארים את הפרוטוקול להזרקה תוך ורידית של clozapine-N-oxide להפעלה עצבית מרחוק ואיסוף דם אוטומטי. טכניקה זו מאפשרת דגימה אוטומטית מתוכנתת כל 5 דקות או יותר לתקופה נתונה, יחד עם הזרקת חומר תוך ורידי בנקודת זמן או משך זמן רצויים. בסך הכל, מצאנו שטכניקה זו היא גישה רבת עוצמה למחקר על בקרה נוירואנדוקרינית.

The hypothalamo-pituitary-gonadal (HPG) axis is centrally regulated by the pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) into the pituitary portal system. In the pituitary gland, GnRH controls the pulsatile release of gonadotropins, luteinizing hormone (LH), and follicle-stimulating hormone (FSH) to the circulatory system. LH pulsatile release serves as a hallmark for central HPG axis functioning1,2,3,4. For example, it displays the effects of genetic alterations or changes in hormonal or environmental factors on the neural part of the axis5,6,7. Until recently, measuring the LH pulsatile pattern was limited to large mammals8 and rats9, given the high frequency of sampling and large blood volumes necessary to identify the pulses.
Detecting LH pulses in mice is desirable since this species has broad genetic models available and can be readily manipulated using genomic engineering technologies to further study specific genes and cell populations. In the last decade, a large advance in the analysis of LH concentrations in mice using a sandwich LH enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has allowed for detecting LH in a minute amount of blood10. The development of the frequent tail-tip blood sampling technique has made possible the necessary frequent sampling for detecting the frequency and amplitude of LH pulses in mice10,11. However, tail-tip blood sampling is limited to its use in conscious awake animals; it demands a long training period for mice to adapt to the handling and the presence of a designated investigator during sampling. Its success is highly susceptible to environmental stressors and may not be suitable for use in mouse strains showing high levels of anxiety. Intra-atrial cannulation has also been used for frequent blood sampling in freely-moving conscious mice12. However, that setup still requires repeated manual blood sampling and restricts animal moving space, while atrial cannulation can lead to dynamic changes in cardiac function. It is therefore desirable to establish a method for blood collection under stress-free conditions in conscious, freely moving, and undisturbed mice without the need for prior training or human handling or presence.
Automated blood or dialysate sampling has been used before for measuring different hormone levels (e.g., melatonin13,14) and their pulsatile secretion (e.g., growth hormone)15 in unrestrained rodents. We herein present a protocol for automated long-term frequent blood sampling in conscious and unrestrained animals, coupled with a timely remote activation of specific neuronal populations using chemogenetic technologies:&#160;the designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs). We will describe the stereotaxic delivery of an adeno-associated virus (AAV) vector and the remote activation by an automated intravenous (IV) delivery of clozapine-N-oxide (CNO)16,17. This protocol allows for the sequential detection of basal levels and induced changes in LH pulsatility in multiple animals at the same time. Both the blood sampling and the IV delivery of the compound are conducted in a time-controlled manner via a computer program eliminating the physical presence of the investigator or the requirement for prior mouse training. This method overcomes the main limitations of manual blood sampling. It allows for blood sampling in a stress-free condition, and simultaneous IV compound delivery coupled with remote neuronal activity control. We show representative results of the use of automated blood sampling alone or combined with remote neuronal activation and discuss its advantages, limitations, and additional uses.

מחבר זרקור: עירוי אוטומטי ודגימת דם לניתוח הורמונלי מדויק בעכברים מודעים

הפעלה עצבית מרחוק יחד עם דגימת דם אוטומטית כדי לגרום ולמדוד הורמון luteinizing במחזור בעכברים

Our goal is to understand the role of specific neuron populations in the regulation of the pulsatile secretion of luteinizing hormone. For this, we require precise control of neuron allocation, identity, and activity, in combination with the sequential collection of blood samples without disturbing or stressing the animals. Current method for collecting sequential blood samples in conscious mice are limited to tail cuts, require a long changing period, and are susceptible to human handling and environmental stresses.Automated infusion and blood sampling can be conducted without presence of investigators, which it limits stress and allows for the capture of hormonal changes in conscious, free-moving, and undisturbed mice. This technique is a asset to neuroscience research as it provides a robust support system. The Michigan Mouse Metabolic Phenotyping Center offers automated infusion and broad sampling experiments as a core service.

נוירונים המבטאים קיספפטין (גן Kiss1) הממוקמים בגרעין הארקואט של ההיפותלמוס הם ממריץ רב עוצמה של GnRH, ולכן, של שחרור LH מבלוטת יותרת המוח24,25. בהדגמת פרוטוקול זה, השתמשנו בהפרשת LH הנגרמת על ידי קיספפטין כדי להמחיש את תפקוד טכניקת דגימת הדם האוטומטית. איור 2 מראה דפוסי LH מייצגים אצל נקבות Kiss1-eYFP בוגרות שקיבלו בעבר זריקה סטריאוטקסית חד-צדדית של AAV-hM3Dq-mCherry בגרעין הארקואט (AP: -4.95, ML: -0.35, DV: -5.7). ה-ChR2-eYFP שימש ככתב פלורסנט לתאי Kiss1. חודש לאחר הניתוח הסטריאוטקסי, העכברים עברו קנולציה של עורק התרדמה והווריד הצווארי וחוברו לדוגם הדם האוטומטי 4 ימים לאחר הניתוח. איסוף הדם לקביעת רמות LH בסיסיות החל למחרת בתדירות דגימה של 10 דקות (מרווח של 7 דקות בין דגימות ל-3 דקות/דגימה) ולאחר מכן הזרקת CNO אוטומטית בעירוי והמשך דגימת דם כל 10 דקות למשך 30 דקות. רמות LH דיאסטרוטיות הן בדרך כלל נמוכות (איור 2A), אולם בדרך כלל נצפות שינויים בגלל שחרור הפעימה שלו (איור 2B). לאחר הזרקת CNO (והפעלת נוירוני קיספפטין), העלייה ב-LH הייתה חדה (תוך 10 דקות). רמת העלייה ומשך השיא תלויים בגורמים רבים, כולל אתר ההזרקה, מספר תאי העצב שהופעלו או האוכלוסייה הממוקדת.
איור 3 מראה את אתר ההזרקה במוח בגרעין הארקואט של נקבת העכבר המיוצג באיור 2A. תאי עצב Kiss1-eYFP מסומנים בירוק, בעוד שתגובתיות החיסון mCherry מראה את האתר של הזרקת AAV והפעלתו לאחר CNO. תאי עצב פעילים זוהו באמצעות תגובתיות חיסונית cFOS, המסומנת ב-DAB. רוב תאי העצב mCherry לוקליזציה עם Kiss1-eYFP, ורבים הראו תגובתיות חיסונית של cFOS, מה שמוכיח כי ההפעלה הנגיפית והעצבית הייתה ספציפית לאוכלוסיית היעד.
דפוס שחרור פולסטילי מייצג של LH בעכברי דיזטרוס פראי (C57BL/6J) ואחריו התגובה להזרקת IP של קיספפטין-10 מוצג באיור 4. העכבר עבר קנולציה של עורק התרדמה וחובר למערכת דגימת הדם האוטומטית 4 ימים לאחר הניתוח. למחרת בבוקר נבדקו מחזורי הייחום ובוצע איסוף הדם וזריקת קיספפטין-10 ביוםה-26. דגימות הדם נאספו כל 7 דקות במשך שעתיים (מרווח של 4 דקות, בתוספת 3 דקות / דגימה במשך 120 דקות לפני ההזרקה) כדי לקבוע את רמות הבסיס ואת פעימות LH, ולאחר מכן הזרקת IP של קיספפטין-10 (65 מיקרוגרם / ק"ג) והמשך איסוף הדם כל 7 דקות במשך 30 דקות נוספות. נצפו פולסי LH ברורים האופייניים לנקבה בדיסטרוס, המראים רמות LH בסיסיות נמוכות, תדירות דופק של ~2 פולסים / שעה, ומשרעת דופק ~ 1 ng/mL27. עלייה מיידית וחזקה ב- LH זוהתה בתגובה למתן קיספפטין28. דפוסי הפרשת LH והשינויים לאחר הגירוי תואמים מחקרים אחרים המשתמשים באיסוף דם ידני 10,27,29,30. תוצאות אלה מראות כי שיטת דגימת הדם האוטומטית לוכדת הפרשת LH טיפוסית ומגורה במצב ללא לחץ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig01.jpg"> איור 1: פרטים על מערכת המחברים וחיבורי העכבר לצינורות מערכת העירוי והדגימה. (A) מחבר צינורות מצופה סיליקון (MASA) שנבנה באמצעות שני צינורות מחט 25G ושני צינורות PE-20, בשרוול בצינור סילסטי המחובר בטבעת מתכת קטנה. (B) עכבר המחובר לעירוי ולצינור הדגימה בכלוב הדגימה, ונח בקן שלו במהלך דגימת הדם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig02.jpg"> איור 2: תוצאות מייצגות עבור פעימות LH בעכברות נקבות Kiss1-Cre שהוזרקו עם AAV-hM3Dq בגרעין הארקואט ומופעלות מרחוק באמצעות CNO. רמות LH בסיסיות נמדדו כל 10 דקות במשך חצי שעה. בזמן 0 לאחר איסוף הדם, הנקבה קיבלה זריקה תוך ורידית של clozapine-N-oxide (0.5 מ"ג / ק"ג) ודם המשיך להיאסף מעורק התרדמה כל 10 דקות במשך חצי שעה נוספת. (A) מראה נקבה עם רמות LH בסיסיות נמוכות. (B) מראה נקבה המציגה קדם-הזרקה של דופק LH. קיצורים: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = וירוס הקשור לאדנו; CNO = clozapine-N-oxide; LH = הורמון luteinization. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig03v2.jpg"> איור 3: פעילות מוחית בגרעין הארקואט של Kiss1-Cre; נקבת Chr2-eYFP (Kiss1-eYFP) המיוצגת באיור 2A. ChR2-eYFP שימש רק כגן עיתונאי כדי לתייג נוירונים של kiss1. (A) תמונה פלואורסצנטית בהגדלה נמוכה המציגה את אתר הזרקת AAV בגרעין הארקואט. ירוק: eYFP immunoreactivity, Magenta: mCherry immunoreactivity. (B) תמונת שדה בהיר בהגדלה נמוכה של האזור המתאים לאיור 3A, המראה תגובתיות חיסונית cFOS (שחור) באתר הזרקת AAV בגרעין ארקואט. (C) פלואורסצנטיות בהגדלה גבוהה ותמונת שדה בהיר בשילוב מראות מבט מקרוב על תאי העצב באיור 3A,B. תאי עצב Kiss1-eYFP המבטאים יחד AAV-mCherry שהופעלו הם אלה עם ציטופלסמה לבנה וגרעין שחור (חצים). פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (A,B), 20 מיקרומטר (C). קיצורים: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = וירוס הקשור לאדנו; eYFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65875/65875fig04.jpg"> איור 4: פעימות LH בסיסיות בנקבת בר מסוג diestrous נמדדו כל 7 דקות במשך שעתיים. לאחר מכן קיבלה הנקבה זריקה תוך-צפקית של קיספפטין-10 (65 מק"ג/ק"ג) בזמן 0, ודגימות דם נאספו ברציפות כל 7 דקות במשך חצי שעה. קיצור: LH = הורמון luteinize. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65875/65875fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Automated Infusion and Blood Sampling for Precise Hormonal Analysis in Conscious Mice at JoVE.com

פעימות הורמון luteinizing (LH) הוא סימן היכר של תפקוד הרבייה. אנו מתארים פרוטוקול להפעלה מרחוק של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות הקשורות לאיסוף דם אוטומטי סדרתי. טכניקה זו מאפשרת אפנון הורמונלי מתוזמן, ריבוב ומזעור השפעות מניפולציה על רמות LH בבעלי חיים הנעים בחופשיות מודעת, וללא הפרעה.

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of ...

מטרתנו היא להבין את תפקידן של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות בוויסות הפרשת ההורמון המחלמן. לשם כך אנו זקוקים לבקרה מדויקת על הקצאת תאי העצב, זהותם ופעילותם, בשילוב עם איסוף רציף של דגימות דם מבלי להפריע או להלחיץ את בעלי החיים. השיטה הנוכחית לאיסוף דגימות דם רציפות בעכברים מודעים מוגבלת לחתכי זנב, דורשת תקופת שינוי ארוכה וחשופה לטיפול אנושי וללחצים סביבתיים.עירוי אוטומטי ודגימת דם יכולים להתבצע ללא נוכחות של חוקרים, מה שמגביל את הלחץ ומאפשר ללכוד שינויים הורמונליים בעכברים מודעים, חופשיים וללא הפרעות. טכניקה זו היא נכס למחקר מדעי המוח כפי שהיא מספקת מערכת תמיכה חזקה. מרכז הפנוטיפינג המטבולי של עכברי מישיגן מציע עירוי אוטומטי וניסויי דגימה רחבים כשירות ליבה.

remote-neuronal-activation-coupled-with-automated-blood-sampling-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Remote Neuronal Activation Coupled with Automated Blood Sampling to Induce and Measure Circulating Luteinizing Hormone in Mice

825 Views.  University of Michigan, Ann Arbor. מטרתנו היא להבין את תפקידן של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות בוויסות הפרשת ההורמון המחלמן. לשם כך אנו זקוקים לבקרה מדויקת על הקצאת תאי העצב, זהותם ופעילותם, בשילוב עם איסוף רציף של דגימות דם מבלי להפריע או להלחיץ את בעלי החיים. השיטה הנוכחית לאיסוף דגימות דם רציפות בעכברים מו?...

Video: מחבר זרקור: עירוי אוטומטי ודגימת דם לניתוח הורמונלי מדויק בעכברים מודעים

Circulating luteinizing hormone (LH) levels are an essential index of the functioning of the hypothalamic-pituitary control of reproduction. The role of numerous inputs and neuronal populations in the modulation of LH release is still unknown. Measuring changes in LH levels in mice is often a challenge since they are easily disrupted by environmental stress. Current techniques to measure LH release and pulsatility require long-term training for mice to adapt to manipulation stress, certain restraint, the presence of the investigator, and working on individual animals, reducing its usefulness for many research questions.
This paper presents a technique to remotely activate specific neuronal populations using Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) technology coupled with automated sequential blood sampling in conscious, freely moving, and undisturbed mice. We first describe the stereotaxic surgery protocol to deliver adeno-associated virus (AAV) vectors expressing DREADDs to specific neuronal populations. Next, we describe the protocol for carotid artery and jugular vein cannulation and postsurgical connection to the CULEX automated blood sampling system. Finally, we describe the protocol for clozapine-N-oxide intravenous injection for remote neuronal activation and automated blood collection. This technique allows for programmed automated sampling every 5 min or longer for a given period, coupled with intravenous substance injection at a desired time point or duration. Overall, we found this technique to be a powerful approach for research on neuroendocrine control.

Luteinizing hormone (LH) pulsatility is a hallmark of reproductive function. We describe a protocol for remote activation of specific neuronal populations linked to serial automated blood collection. This technique allows timed hormonal modulation, multiplexing, and minimizing manipulation effects on LH levels in conscious freely moving, and undisturbed animals.

Stereotaxic Delivery of Adeno-Associated Viruses to a Specific Cell Population Linked to Serial Automated Blood Collection

To begin, inject a preemptive analgesic into an anesthetized mouse. Using clippers, shave the head of the mouse. Install the animal on a stereotaxic table and correctly position ear bars.Attach the mouse's mouth to the mouse piece and carefully position the tongue outside to prevent suffocation. After checking the depth of anesthesia, position elevation support beneath the animal to ensure the body and head remain leveled horizontally. And use a warm pad with paper to maintain the animal's temperature.Apply ointment to both eyes to prevent dryness. Then, using iodine and alcohol, disinfect the mouse's head. Use a scalpel to make an incision along the head's midline with the cut stretching from behind the eyes to post the lambda suture.Expose the skull and swab it with a sterile cotton tip saturated in 0.9 sodium chloride solution. Under a stereo microscope, identify the rostral rhinal vein or RRV and use a sterile pencil to mark it. Using a sterile needle as a reference, confirm the orientation of the brain.Ensure no change in the DV and ML coordinates. Next, position a sterile glass pipette containing the virus solution to the RRV reference for zero anteroposterior reference. Advance the pipette along the sagittal suture until reaching the chosen anteroposterior coordinate.Mark this spot with a sterile pencil and lift the needle. Carefully drill a small circle around the marked position to avoid breaking the superior sagittal sinus, and remove the piece of the skull with small forceps. Then, using the superior sagittal sinus median as the mediolateral reference, move the pipette to the position and lower it until it touches the dura mater as the dorsoventral reference.Create a slight break in the dura mater and lower the pipette to the preferred dorsoventral position. Inject the specified quantity of adeno-associated virus or AAV vectors into the brain and remove the pipette. Free the mouse from the ear bars, then close the skin using surgical clips.transition the animal into a separate warmed cage to recover. Keep an eye on the mouse's recovery. Once it regains consciousness, return it to its original enclosure when fully recovered.

העברה סטריאוטקסית של וירוסים הקשורים באדנו לאוכלוסיית תאים ספציפית המקושרת לאיסוף דם אוטומטי סדרתי

Jugular Vein and Carotid Artery Canulation for Automated Blood Sampling in Mice

To begin, inject the mouse with AAV-associated vectors into the mouse brain. After three to four weeks of virus injection, shave the ventral and back areas of the neck of an anesthetized mouse. Clean the shaved areas using three iodine scrubs in rotation with 70%ethanol solution.Make a ventral incision in the skin between the shoulder blades. Afterward, place surgical gauze over the incision and position the animal in a supine state, with its head facing toward the surgeon. Then make a small vertical incision on the right side of the neck, above the clavicle, to expose the right carotid artery and jugular vein.After separating the subcutaneous tissue, expose the right external jugular vein and place the suture under the vein. Tie off the distal end of the jugular vein to halt the blood flow. Using micro forceps and scissors, make a small incision in the collapsed vein.Now, insert the venous catheter with the bevel facing downward, and move it proximally towards the superior vena cava until it reaches the right atrium. Using a 7-0 silk suture, secure the catheter to the vessel. Dissect the connective tissues to expose the right common carotid artery.Proximally, pre-place two 7-0 silk sutures'suture loops that remain unfastened at the level where the internal and external carotid arteries divide. To stop the blood flow temporarily, pull a pre-placed suture loop. Then, using micro scissors or a 27-gauge needle, create a small opening on the vessel wall.Insert the arterial catheter proximally while releasing the suture loop, and advance the catheter to reach the aorta arch, without touching the aortic valve. Use the two pre-placed sutures to fasten the catheter to the vessel. Tunnel all catheters subcutaneously, exteriorize them at the back of the neck via the pre-cut incision, and close the ventral incision.Join the catheters to the venous or arterial ports of the silicone-coated tubing connector made from 25-gauge needle tubing. After closing the ventral incision, secure the connector subcutaneously when the back skin is sealed with sutures. Using stainless steel surgical wires, fill the catheters with heparinized saline and tightly plug the ends of the catheters.To attach the animal on an automated blood collection system 24 hours postsurgery, connect the tether hook to the metal ring on the back of the neck and connect the arterial line. Once the arterial catheter is connected to the injection line, attach the venous catheters to the sampling lines. Set the injection time and dose at 0.5 milligrams per kilogram at 500 microliters per minute.Set the blood sampling time and frequency, including the sample dilution with saline. The system will automatically replenish an equal amount of saline to replace the sampled blood. Perform automated pre-injection.Next, perform an automated intravenous injection of the drug clozapine N-oxide at an injection rate of 500 microliters per minute. Then perform post-injection blood sampling. Luteinizing hormone patterns in adult Kiss1-EYFP females that received a unilateral stereotaxic injection of AAV-hM3Dq-mCherry in the arcuate nucleus are presented.Diestrus luteinizing hormone levels are generally low, but variations are usually observed because of its pulsatile release. A sharp rise in luteinizing hormone levels occurs in response to clozapine N-oxide injection. Most mCherry neurons co-localized with Kiss1-EYFP demonstrated that the viral and neuronal activation is specific to the targeted population.A luteinizing hormone pulsatile pattern of release in diestrus wild-type mice, followed by the response to an IP injection of Kisspeptin-10, is shown. Clear luteinizing hormone pulses, typical for a female in diestrus, were observed, showing low basal luteinizing hormone levels. An immediate and robust increase in luteinizing hormone was detected in response to Kisspeptin administration.