תודה לרוזנה קלדרון, דומיניק שיילר ורוזה סיירה על הייעוץ הטכני. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק בלתי מוגבל למחלקה לרפואת עיניים בבית הספר לרפואה של USC Keck ממחקר למניעת עיוורון (AN), NIH K08EY030924 (AN), קרן לאס מדרינאס בטיפולים ניסיוניים לרפואת עיניים (AN), פרס מחקר למניעת עיוורון לפיתוח קריירה (AN), קרן העיניים הטמפלרית (AN), וקרן הזיכרון ע"ש אדוארד נ' ודלה ל' ת'ום (AN, KG).

כל ההליכים בוצעו בהתאם ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת דרום קליפורניה. 14 (n = 14) ארנבים בעלי חגורה הולנדית בגילאי 4 עד 6 חודשים שימשו בפיתוח פרוטוקול זה. נעשה שימוש בבעלי חיים זכרים ונקבות כאחד. כל בעלי החיים שקלו בין 2.0 ל -2.5 ק"ג. כל בעלי החיים שוכנו ביחידות. רשימה של חומרים וציוד מומלצים ניתן למצוא בטבלת החומרים.
1. הכנה
<ol><li>הכנה מקבעת.<ol><li>הכינו 4% פרפורמאלדהיד (PFA) במי מלח חוצצי פוספט (PBS). לכל הפחות, 50 מ"ל של קיבוע נדרש לכל עין.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת סוכן Cryoprotective.<ol><li>הכינו 30% משקל לפי נפח (w/v) סוכרוז ב-PBS. הניחו על שייקר למשך 15 דקות לפחות כדי לוודא שהסוכרוז מומס לחלוטין. לכל הפחות, 50 מ"ל של סוכן cryoprotective נדרש לכל עין.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת מכשיר דיסקציה.<ol><li>אספו שני זוגות מלקחיים, זוג מספריים מעוקלים, להב אזמל אחד וכלי דיסקציה בקוטר 100 מ"מ והניחו אותם ליד מיקרוסקופ דיסקציה. הגדרה לדוגמה מוצגת באיור 1A.</li>
	</ol></li>
</ol>2. קיבוע ראשוני
<ol><li>לאחר שאיבה טרנס-לחמית11, הניחו מיד את העין בלפחות 50 מ"ל של 4% PFA ב-PBS על קרח. ודא כי העין שקועה לחלוטין. אם בועות אוויר מצטברות על פני השטח החיצוניים של העין, הסירו אותן על ידי טלטול עדין.</li>
</ol>3. הסרת קרנית וקשתית
<ol><li>לאחר 15 דקות, הסירו את העין מ-4% PFA ב-PBS והניחו אותה בכלי דיסקציה של 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ נתיחה. מלאו את המנה ב-PBS כדי למנוע מהעין להתייבש.</li>
	<li>הסר את הקרנית.<ol><li>התחילו ביצירת חתך עם להב כירורגי 1 מ"מ קדמי ללימבוס, במקביל למישור הקשתית כדי למנוע ניקוב בטעות של מבנים מתחתיו (איור 1B).</li>
		<li>יש להכניס מספריים מעוקלים לחתך הראשוני ולהמשיך לחתוך היקפית תוך שמירה על מרחק של 1 מ"מ מהלימבוס. השתמשו במלקחיים כדי לייצב את העין בזמן החיתוך (איור 1C).</li>
		<li>לאחר השלמת החתך ההיקפי, יש להסיר את הקרנית בעזרת מלקחיים ולנגב בעדינות עודפי PBS עם מגבון מעבדה. הניחו את הקרנית בתמיסת 30% סוכרוז בטמפרטורת החדר (RT) להגנה קריואקטיבית או להשלכה. Cryoprotection הוא שלם כאשר הקרנית שוקעת, אשר בדרך כלל לוקח פחות מ 1 שעה.</li>
	</ol></li>
	<li>הסר את הקשתית.<ol><li>התחל על ידי ביצוע חיתוך ראשוני עם מספריים מעוקלים דרך הקשתית. הפרידו לחלוטין את הקשתית משאר הרקמה על-ידי חיתוך דומה להסרת הקרנית (איור 1D).</li>
		<li>לאחר השלמת החתך ההיקפי, הסירו את הקשתית במלקחיים ונגבו בעדינות עודפי PBS עם מגבון מעבדה. הניחו את הקשתית בתמיסת 30% סוכרוז ב-RT להגנה קריואקטיבית או השליכו כאמור לעיל. הגנה מפני קרינה מלאה כאשר הקשתית שוקעת, פעולה שנמשכת בדרך כלל פחות מ-30 דקות.</li>
	</ol></li>
</ol>4. השלמת הקיבוע
<ol><li>לאחר הסרת הקרנית והקשתית, הניחו את העין בלפחות 50 מ"ל של 4% PFA טרי שהוכן ב-PBS והניחו אותו על שייקר לתסיסה עדינה. ודא שהעין נשארת שקועה במהלך אי שקט.</li>
	<li>שמור את העין ב 4% PFA ב PBS ב 4 °C (75 °F) למשך הלילה. הערה: מצאנו כי 4% PFA גורם לצביעת IHC מעולה אם משתמשים בו בין 16 שעות ל -24 שעות ב -4 מעלות צלזיוס, עם משכי קיבוע ארוכים יותר וכתוצאה מכך צביעת רקע לא ספציפית מוגברת ומיסוך אפיטופ.</li>
</ol>5. הסרת עדשה
<ol><li>למחרת בבוקר, להסיר את העין מ 4% PFA ב PBS ולהניח אותו בכלי דיסקציה 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ ניתוח. מלאו את המנה ב-PBS כדי למנוע מהעין להתייבש.</li>
	<li>הסירו את העדשה.<ol><li>התחל על ידי אחיזה זהירה של קפסולת העדשה הקדמית עם מלקחיים. הערה: היזהר מאוד לא לדחוף או למשוך בכוח את העדשה עם המלקחיים מכיוון שזה יכול ליצור היפרדות רשתית.</li>
		<li>הכניסו בזהירות את המספריים לחדר האחורי כשהלהבים מעוקלים אחורית לאורך העדשה. בצע חיתוך ראשוני דרך זונולי העדשה עם מספריים מעוקלים. הערה: היזהרו מאוד לא לדחוף או למשוך בכוח את הזונולים עם המספריים, שכן זה יכול ליצור היפרדות רשתית (איור 1E).</li>
		<li>המשיכו לבצע חתכים קטנים דרך זונולי העדשה בתבנית היקפית. בצע שלושה עד חמישה חיתוכים בכל שעת שעון.</li>
		<li>כדי לבדוק אם העדשה מופרדת משאר הרקמה, אחזו בעדינות בכמוסת העדשה הקדמית בעזרת מלקחיים ונסו להרים אותה בעדינות. אם העדשה אינה מתרוממת מיד, אל תנסה למשוך יותר מכיוון שהדבר עלול ליצור היפרדות רשתית. במקום זאת, בצע חתכים נוספים דרך זונולי העדשה הנותרים ונסה שוב.</li>
		<li>לאחר הפרדה משאר הרקמה, הניחו את העדשה בתמיסת 30% סוכרוז ב-RT להגנה קריו-פרוטקטורית או השליכו אותה כאמור לעיל. הגנה מפני קריוהגנה מלאה כאשר העדשה שוקעת, פעולה שנמשכת בדרך כלל מספר שעות.</li>
	</ol></li>
	<li>מקם את העין לפחות 50 מ"ל של 30% סוכרוז ב PBS ב 4 ° C עבור cryoprotection. Cryoprotection הוא שלם כאשר העין שוקעת, אשר בדרך כלל לוקח 24-48 שעות. כדי לזרז הגנה קריו-הגנה, החליפו את תמיסת הסוכרוז הראשונית בתמיסת סוכרוז טרייה לאחר 8-12 שעות ו/או שמרו על העין בתמיסת סוכרוז ב-RT.</li>
</ol>6. הטבעה
<ol><li>לאחר השלמת ההגנה מפני קריותרפיה, הסר את העין מתמיסת 30% סוכרוז והנח אותה בכלי דיסקציה של 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ ניתוח. בזהירות להפוך את העין כך שהיא פונה כלפי מטה כדי להסיר תמיסת סוכרוז עודפת מהחלק הפנימי של העין. הערה: אין לנסות להסיר תמיסה עודפת מהחלק הפנימי של העין באמצעות מגבון מעבדה מכיוון שהמגבון עלול להידבק לגוף הזגוגית ולגרום להיפרדות רשתית.</li>
	<li>כשהעין פונה כלפי מטה, נגבו בעדינות את עודפי תמיסת הסוכרוז מהחלק החיצוני של העין באמצעות מגבון.</li>
	<li>ממלאים תבנית הטבעה חד פעמית בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לעומק של 0.5-1.0 ס"מ. הערה: בסיס זה מבטיח שהעין לא תיגע בתחתית התבנית, מה שמפריע להקפאה מאוחר יותר.</li>
	<li>מניחים את העין בתבנית ההטבעה החד פעמית הפונה כלפי מעלה. לאט למלא את החלק הפנימי של העין עם OCT תוך הקפדה מיוחדת על מנת למנוע היווצרות בועות בתוך העין. אם נוצרות בועות, הסירו אותן בזהירות או דחפו אותן לקצה התבנית בעזרת מלקחיים.</li>
	<li>סיימו למלא את תבנית ההטבעה החד פעמית ב-OCT. ודאו שהעין שקועה לחלוטין ב-OCT ואינה נוגעת במשטחים הפנימיים של התבנית או חשופה לאוויר. לעטוף את תבנית הטבעה חד פעמית המכילה את העין ב OCT ב parafilm; יש להניח על 4 °C (75 °F) למשך הלילה. הערה: מניסיוננו, תקופות דגירה קצרות יותר אינן מאפשרות ל-OCT לחדור לחלוטין לזגוגית. כתוצאה מכך, שכבה של סוכרוז נשארת לעתים קרובות בין הרשתית לבין OCT. כאשר זה קורה, הרשתית לעתים קרובות מתנתקת או נקרעת לחלוטין משאר הרקמה במהלך הקפאה מכיוון שסוכרוז קפוא ככל הנראה מספק פחות תמיכה מבנית מאשר OCT קפוא, מה שהופך חלקים באיכות גבוהה לקשים או אפילו בלתי אפשריים להשגה.</li>
	<li>למחרת בבוקר, מניחים את תבנית ההטבעה המכילה את העין ב-OCT בכלי דיסקציה של 100 מ"מ תחת מיקרוסקופ ניתוח. ודא שהקרום ההיאלואידי האחורי נראה מורם כלפי מעלה מהרשתית הפנימית. הערה: הרמה זו כלפי מעלה עלולה לטשטש את שדה הראייה של הרשתית, מה שמקשה על קביעת ההתמצאות.</li>
	<li>כדי לקבוע טוב יותר את כיוון העין, אחוז בזהירות את הקרום ההיאלואידי האחורי קדמית ונסה לקלף אותו עם מלקחיים כדי לחשוף את הרשתית הבסיסית בזמן OCT. הערה: לפעמים התעלה ההיאלואידית נראית לעין, אשר מתחברת לראש עצב הראייה ויכולה לשמש למטרות התמצאות מאחר שראש עצב הראייה ממוקם בחלק העליון של הרשתית (איור 2A). אין צורך להסיר לחלוטין את הקרום ההיאלואידי האחורי מאחר ש-OCT כבר חדר לגוף הזגוגית כדי לרפד את הרשתית הפנימית, וכל קרום שנותר לא ישפיע על הקפאה (איור 2B). יש להסיר את הקרום ההיאלואידי האחורי רק לצורך התמצאות, במידת הצורך. אפשרויות אחרות לקביעת כיוון כוללות הנחת תפר או סוג אחר של סימן לפני השאיבה.</li>
	<li>העבירו את העין לתבנית הטבעה חדשה עם OCT חדש במילוי לעומק של 0.5-1.0 ס"מ ולאחר מכן מלאו ב-OCT חדש כמו בשלבים 6.3-6.5 כדי להבטיח שאמצעי ההטבעה הסופי נקי מלכלוך ו/או פגמים אחרים שאולי הצטברו במהלך הלילה. אם אפשר, להסיר בעדינות OCT עם מגבון מתוך העין גם כן, אם כי זה לא הכרחי.</li>
	<li>תייגו את התבנית למטרות התמצאות (איור 2C). כיוון העין כשהעין פונה כלפי מעלה בתבנית הקריו מבטיח כי OCT ירפד את הרשתית הפנימית. התעלה ההיאלואידית, המתחברת לראש עצב הראייה, היא נקודת ציון חשובה לקביעת החלק העליון של העין (איור 2A).</li>
	<li>מניחים את תבנית ההטבעה המסומנת המכילה את העין ב-OCT על גבי קרח יבש. יש לוודא שהעין אינה נוגעת באף אחד מהמשטחים הפנימיים של העובש המוטבע או חשופה לאוויר. ודאו שהעובש נוגע ישירות בקרח היבש כדי להאיץ את תהליך ההקפאה (איור 2D).</li>
	<li>העבירו את העין המשובצת למקפיא בטמפרטורה של -80°C או ישירות להקפאה לצורך חתך (איור 2E).</li>
</ol>7. Cryosectioning
<ol><li>הרכיבו את הגוש כאשר החלק העליון של העין פונה למעלה והחלק התחתון של העין פונה בצורה נחותה, כאשר הקרנית והקשתית הנותרות פונות ימינה (כמו באיור 2E) או שמאלה (לא מוצגות). לחלופין, טען את הבלוק בכיוון שונה, לפי הצורך. במידת הצורך, שברו את התבנית כדי לגייס את הבלוק על ידי שבירה זהירה של כל צד של התבנית אחד בכל פעם וסימון הבלוק ישירות כדי לא לאבד את כיוון העין.</li>
	<li>לאפשר את הבלוק כדי לאזן את הטמפרטורה בתוך cryostat במשך 30-60 דקות; -20 °C היא נקודת התחלה טובה.</li>
	<li>לאחר ההרכבה, הניחו להב חדש בזווית הרצויה, בדרך כלל במקביל לציר האנכי של העין.</li>
	<li>הגדר את עובי המקטע כרצונך: חתכים בעובי 10-20 מיקרומטר הם נקודת התחלה טובה. דוגמה לחתך בעובי 14 מיקרומטר מודגמת באיור 3A-C.<ol><li>באופן איטי ומבוקר, התחילו לחתך דרך הבלוק. ודא שהלהב חותך את הבלוק במקביל לציר האנכי של העין. אם לא, התאימו בהתאם את זווית מגע הלהב עם הבלוק או כיוון הבמה.</li>
		<li>בעת חיתוך הבלוק יש למנוע קמטים או סלסולים של הקטע בעזרת מברשת. הפכו במהירות את החלק והפעילו לחץ עדין כלפי מטה בעזרת מברשת בעלת שיער ארוך כדי לשטח את המקטע ולמזער קמטים או סלסולים. עצבו מברשת נפרדת עם קצה מחודד כדי לסייע במניפולציה של המקטע.</li>
	</ol></li>
	<li>חבר את המקטע לשקופית זכוכית טעונה על-ידי הזזת השקופית באיטיות הפונה כלפי מטה לכיוון המקטע. מנעו מהמקטע להתקפל על עצמו או לעוות את עצמו בדרך אחרת במהלך החיבור על ידי גלגול עדין של מגלשת הזכוכית מעל המקטע. הערה: אל תרחף עם השקופית ישירות מעל המקטע ואל תלחץ עליה כנגד המקטע, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק או לעוות את המקטע.</li>
	<li>הניחו לשקופיות להתייבש למשך הלילה לפני העברתן למקפיא בטמפרטורה של -80°C או המשיכו ישירות לפרוטוקול אימונופלואורסנציה סטנדרטי.</li>
</ol>

דיסקציה של עין ארנב וקריוסקציה ללימודי אימונוהיסטוכימיה

<ol>
	<li>Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19-Models+in+ophthalmology+and+vision+research.">Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research.</a> American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).</li><li>Davis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+and+histology+of+the+eye+and+orbit+of+the+rabbit.">The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).</li><li>Zernii, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+models+of+ocular+diseases:+New+relevance+for+classical+approaches.">Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches.</a> CNS &amp; Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Pang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+preparation+of+mouse+eye+sections+for+routine+histology,+immunofluorescence,+and+RNA+in+situ+hybridization+multiplexing.">Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100879 (2021).</li><li>Sorden, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+background+and+procedure-related+microscopic+findings+and+common+artifacts+in+ocular+tissues+of+laboratory+animals+in+ocular+studies.">Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies.</a> Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Mitchell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+in+companion+animals.">Enucleation in companion animals.</a> Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).</li><li>Kastan, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+inhibitor+of+Lats+kinases+to+promote+regeneration+of+mammalian+organs.">Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119 (2022).</li><li>Baiza-Dur&#225;n, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+evaluation+after+repeated+intravitreal+injections+of+a+humanized+anti-VEGF-A+monoclonal+antibody+(PRO-169)+versus+ranibizumab+in+New+Zealand+white+rabbits.">Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits.</a> Int J Retina Vitreous. 6, 32 (2020).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+changes+in+intraretinal+oxygen+distribution+in+pigmented+rabbits.">Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).</li><li>Faude, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+artificial+retinal+detachment+for+macular+translocation+surgery+tested+in+rabbit.">Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

לפני יישום הפרוטוקול הנ"ל, נתקלנו באופן עקבי בקשיים בעיבוד רקמות של עיני ארנב עבור IHC. התאמנו כמה פרוטוקולים מעיניהם של בעלי חיים קטנים יותר, כגון עכברים, אך מצאנו שהם מובילים לקיבוע לקוי ולקושי בחיתוך רקמות. ישנם מספר שיקולים חשובים המאפשרים חלקים עקביים ואיכותיים של רשתית הארנבת.
<p class="...

הרשתית מורכבת מכמה שכבות של תאים מתמחים בתוך העין שיחד פועלים להמרת אור לאותות עצביים. מכיוון שהרשתית ממלאת תפקיד קריטי בראייה, הבנת המבנה והתפקוד שלה יכולה לספק תובנות חשובות לגבי כמה מהגורמים הנפוצים ביותר לאובדן ראייה כגון ניוון מקולרי ורטינופתיה סוכרתית, בין היתר.
ארנבים משמשים כמודל נוח לבעלי חיים במחקר רשתית מכיוון שהם מציעים מספר יתרונות בהשוואה למודלים אחרים. עיני ארנב דומות יחסית באנטומיה לעיניים אנושיות 1,2. לדוגמה, לארנבים יש אזור של צפיפות פוטורצפטור מוגברת, המכונה פס חזותי אופקי, המקביל לגומה המרכזית בבני אדם. למודלים נפוצים אחרים של בעלי חיים, כגון מכרסמים, אין מקבילה אנטומית. בנוסף, בהשוואה למכרסמים, כלי הדם ברשתית בארנבים דומים למדי לאלה שבבני אדם. עיני ארנב גדולות יחסית גם כן. זה הופך אותם למתאימים במיוחד למחקרים הכוללים מתן תרופות או התערבות כירורגית בתוך הזגוגית או הרשתית שאחרת עשויים להיות קשים או בלתי אפשריים בעין קטנהיותר 3.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה נפוצה לחקר לוקליזציה של אנטיגנים בתוך רקמה ויש לה יישומים נרחבים במחקר רשתית 4,5,6. מכיוון שהרשתית היא מבנה עדין, השגת תוצאות שימושיות באמצעות IHC דורשת עיבוד רקמות זהיר. היפרדות רשתית וממצאים רקמתיים אחרים כגון שברים ברשתית או קפלים מתרחשים בדרך כלל במהלך העיבוד ועלולים להפריע לפרשנות התוצאות. עיבוד מוצלח תלוי במגוון גורמים, כולל מניפולציה של רקמות, סוג ומשך הקיבוע, סוג מדיה הטבעה וטכניקות חתך 7,8,9,10. למרות היתרונות של שימוש בארנבים כמודל לבעלי חיים במחקר רשתית, קיימים מעט מאוד פרוטוקולים המתארים עיבוד רקמות מוצלח של רשתית הארנבת. מאמר זה מתאר שיטה אמינה להשגת חתכי רשתית באיכות גבוהה מעיני ארנב שלמות לשימוש ב- IHC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-106</td>
			<td>For fixation and cryoprotection (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Cover</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-SOX2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2018</td>
			<td>Diluted 1:100 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-profile disposable cryostat blades</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>14035838926</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td>Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-RPE65</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NB100-355SS</td>
			<td>Diluted 1:100 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur Sucrose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>167117</td>
			<td>Used for cryoprotectant (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>18646A</td>
			<td>Used as embedding mold (step 6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade no. 15</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Used as embedding media (step 6)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality cryosections of whole rabbit eye 

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג קריוסקציות רשתית באיכות גבוהה בבעלי חיים גדולים יותר, כגון ארנבות. לאחר האינוקלציה, העין שקועה לזמן קצר בקיבוע. לאחר מכן, הקרנית והקשתית מוסרים והעין נשארת לילה לקיבוע נוסף ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע, העדשה מוסרת. לאחר מכן מכניסים את העין לקריומולד וממלאים אותה במדיום הטבעה. על ידי הסרת העדשה, למדיום ההטבעה יש גישה טובה יותר לזגוגית ומוביל ליציבות רשתית טובה יותר. חשוב לציין, יש לדגור את העין בהטבעה בינונית למשך הלילה כדי לאפשר חדירה מלאה לכל הזגוגית. לאחר הדגירה בלילה, העין קפואה על קרח יבש ונחתכת. ניתן להשיג קטעי רשתית שלמים לשימוש באימונוהיסטוכימיה. ניתן להשתמש בפרוטוקולי צביעה סטנדרטיים כדי לחקור את הלוקליזציה של אנטיגנים ברקמת הרשתית. היצמדות לפרוטוקול זה מביאה לקריוסקציות רשתית באיכות גבוהה שניתן להשתמש בהן בכל ניסוי באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

The retina is composed of several layers of specialized cells within the eye that together work to convert light into neural signals. Because the retina plays a critical role in vision, understanding its structure and function can provide valuable insights into some of the most common causes of vision loss such as macular degeneration and diabetic retinopathy, among others.
Rabbits serve as a convenient animal model in retinal research as they offer several advantages compared to other models. Rabbit eyes are relatively similar in anatomy to human eyes1,2. For example, rabbits have an area of increased photoreceptor density, known as the horizontal visual streak, that is analogous to the fovea in humans. Other commonly used animal models, such as rodents, do not have an anatomic equivalent. In addition, compared to rodents, the retinal vasculature in rabbits is fairly similar to that in humans. Rabbit eyes are relatively large as well. This makes them particularly suitable for studies that involve drug administration or surgical intervention within the vitreous or retina that may otherwise be difficult or impossible in a smaller eye3.
Immunohistochemistry (IHC) is a widely used technique to study the localization of antigens within a tissue and has broad applications in retinal research4,5,6. Because the retina is a delicate structure, obtaining useful results via IHC requires careful tissue processing. Retinal detachment and other tissue artifacts such as retinal breaks or folds commonly occur during processing and may interfere with the interpretation of results. Successful processing depends on a variety of factors, including tissue manipulation, type and duration of fixation, type of embedding media, and sectioning techniques7,8,9,10. Despite the advantages of using rabbits as an animal model in retinal research, very few protocols describing successful tissue processing of the rabbit retina exist. This paper describes a reliable method for obtaining high-quality retinal sections from whole rabbit eyes for use in IHC.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של עיבוד רקמות רשתית עבור אימונוהיסטוכימיה במודלים של ארנבים

השגת קריוקציות באיכות גבוהה של עין ארנב שלמה 

Our research focuses on novel approaches to regenerating the retinal pigment epithelium. Dysfunction of the retinal pigment epithelium is thought to play a central role in the pathophysiology of many eye diseases, such as macular degeneration, so regenerating this layer of cells is attractive from a therapeutic standpoint. Visualizing the structural anatomy of the retina via immunohistochemistry has wide applications in retinal research.In our laboratory, we found obtaining useful results from rabbit eyes, difficult due to tissue artifacts like retinal attachments and retinal folds. Despite these challenges, there are very few protocols existing that describe successful tissue processing of rabbit retina. This protocol makes several important modifications to standard tissue processing techniques that result in excellent tissue sections of the rabbit retina.This study may allow researchers to obtain better results from their research that involves the use of immunohistochemistry in rabbit models.

לאחר עיבוד רקמות, ניתן להשתמש בפרוטוקול אימונופלואורסנציה סטנדרטי כדי לחקור כל מספר של תהליכים ביולוגיים בתוך הרשתית. איור 3A-C ממחיש תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של חתך רשתית המתקבל באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. קטע הרשתית היה מוכתם חיסון על פי פרוטוקול<s...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Optimizing Retinal Tissue Processing for Immunohistochemistry in Rabbit Models at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להשגת קריוסקציות באיכות גבוהה של עיני ארנב שלמות. הוא מפרט את הליכי הדיסקציה, הקיבוע, ההטבעה והחתך של עין הארנב, אשר עשויים להיות מותאמים בקלות לשימוש בכל מחקר המשתמש באימונוהיסטוכימיה בעיניים גדולות יותר.

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed ...

המחקר שלנו מתמקד בגישות חדשניות לחידוש אפיתל פיגמנט הרשתית. תפקוד לקוי של אפיתל פיגמנט הרשתית נחשב כממלא תפקיד מרכזי בפתופיזיולוגיה של מחלות עיניים רבות, כגון ניוון מקולרי, ולכן התחדשות שכבת תאים זו אטרקטיבית מבחינה טיפולית. להדמיית האנטומיה המבנית של הרשתית באמצעות אימונוהיסטוכימיה יש יישומים נרחבים במחקר הרשתית.במעבדה שלנו, מצאנו קבלת תוצאות מועילות מעיני ארנב, קשה בגלל ממצאים רקמתיים כמו חיבורי רשתית וקפלי רשתית. למרות אתגרים אלה, קיימים מעט מאוד פרוטוקולים המתארים עיבוד רקמות מוצלח של רשתית הארנבת. פרוטוקול זה מבצע מספר שינויים חשובים בטכניקות עיבוד רקמות סטנדרטיות המביאות לקטעי רקמה מצוינים ברשתית הארנבת.מחקר זה עשוי לאפשר לחוקרים להשיג תוצאות טובות יותר מהמחקר שלהם הכולל שימוש באימונוהיסטוכימיה במודלים של ארנבים.

obtaining-high-quality-cryosections-of-whole-rabbit-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining High-Quality Cryosections of Whole Rabbit Eye 

1.1K Views.  University of Southern California. המחקר שלנו מתמקד בגישות חדשניות לחידוש אפיתל פיגמנט הרשתית. תפקוד לקוי של אפיתל פיגמנט הרשתית נחשב כממלא תפקיד מרכזי בפתופיזיולוגיה של מחלות עיניים רבות, כגון ניוון מקולרי, ולכן התחדשות שכבת תאים זו אטרקטיבית מבחינה טיפולית. להדמיית האנטומיה המבנית של הרשתית באמצעות אימו...

Video: מחבר זרקור: אופטימיזציה של עיבוד רקמות רשתית עבור אימונוהיסטוכימיה במודלים של ארנבים

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed in the fixative. Then, the cornea and iris are removed and the eye is left overnight for additional fixation at 4 &#176;C. Following fixation, the lens is removed. The eye is then placed in a cryomold and filled with an embedding medium. By removing the lens, the embedding medium has better access to the vitreous and leads to better retinal stability. Importantly, the eye should be incubated in embedding medium overnight to allow complete infiltration throughout the vitreous. Following overnight incubation, the eye is frozen on dry ice and sectioned. Whole retinal sections may be obtained for use in immunohistochemistry. Standard staining protocols may be utilized to study the localization of antigens within the retinal tissue. Adherence to this protocol results in high-quality retinal cryosections that may be used in any experiment utilizing immunohistochemistry.

This protocol describes a reliable method for obtaining high-quality cryosections of whole rabbit eyes. It details rabbit eye dissection, fixation, embedding, and sectioning procedures, which may be easily adapted for use in any study utilizing immunohistochemistry in larger eyes.

Whole Rabbit Eye Dissection and Ocular Tissue Preparation for Histological Analysis

After transconjunctival enucleation of the rabbit eye, immediately place in 50 milliliters of 4%paraformaldehyde and PBS on ice. After 15 minutes, transfer the eye to a 100 millimeter dissection dish and fill the dish with PBS to prevent the eye from drying out. Under a dissection microscope, Using a surgical blade, start making an incision one millimeter anterior to the limbus, keeping it parallel to the iris plane.Insert curved scissors into the initial incision and continue cutting circumferentially, maintaining a one millimeter distance from the limbus. Then remove the cornea with forceps and gently wipe away PBS With a laboratory wipe. Place the cornea in 30%sucrose solution at room temperature for cryoprotection.Make an initial cut with curved scissors through the iris. Then cut circumferentially around the eye, similar to the cornea removal, to separate the iris from the rest of the tissue. Remove the iris with forceps and gently wipe away excess PBS with the laboratory wipe.Place the iris in 30%sucrose solution at room temperature for cryoprotection. After removing the cornea and iris, place the eye in 50 milliliters of 4%paraformaldehyde and put it on a shaker for gentle agitation. Leave the eye in 4%paraformaldehyde at four degrees Celsius overnight.The next day, place the eye in a dissection dish and fill the dish with PBS. Under the dissection microscope, use forceps to carefully grasp the anterior lens capsule. Then carefully insert the scissors into the posterior chamber, orienting the blades posteriorly along the lens.Make an initial cut through the lens zonules with curved scissors. Continue making small cuts in a circumferential pattern through the lens zonules. To confirm lens removal, gently grasp the anterior lens capsule with forceps and attempt to lift it.Upon separation, place the lens in 30%sucrose solution at room temperature for cryoprotection. Place the eye in 50 milliliters of 30%sucrose and PBS at four degrees Celsius for 24 to 48 hours for cryoprotection. To expedite cryoprotection, replace the initial sucrose solution with a fresh one after eight to 12 hours.

דיסקציה של עין ארנב שלם והכנת רקמת עין לניתוח היסטולוגי

Ocular Tissue Embedding and Cryosectioning in Optimal Cutting Temperature Compound for Fluorescence Imaging 

After cryo protection of the rabbit eye is complete, transfer it from a 30%sucrose solution to a 100 millimeter dissection dish. Under a dissecting microscope, carefully flip the eye to remove excess sucrose solution from the inner part of the eye. Using a wipe, gently wipe away excess sucrose solution from the outer part of the eye, fill a disposable embedding mold with optimal cutting temperature or OCT compound to a depth of 0.5 to one centimeter.Place the eye in the embedding mold facing upward and slowly fill the inner part of the eye with OCT compound, avoiding bubble formation. Once the eye is emerged in the OCT compound, and does not touch the inner surfaces of the mold, wrap the embedding mold in paraffin and store it at four degrees Celsius overnight. The next day, place the embedding mold in a dissection dish.If possible, gently remove the OCT compound from the inside of the eye with a wipe. Transfer the eye to a new embedding mold filled with fresh OCT compound. Then fill the mold as previously done to ensure the final embedding medium is free of debris or imperfections.Label the mold for orientation purposes. Position the eye upward in the cryo mold, so the OCT compound lines the inner retina. Use the optic nerve head as a landmark for determining the superior part of the eye Place the labeled embedding mold on dry ice, ensuring that the eye is not touching the inner surfaces of the mold or exposed to air.Mount the block on the cryostat with the superior part of the eye facing up and the inferior part down. With the remaining cornea and iris facing to the right or left. Position a fresh blade parallel to the vertical axis of the eye to section it.After cutting the sections and drying overnight, place a slide in a freezer at 80 degrees Celsius. The fluorescence images of a whole retinal cryosection of rabbit eye demonstrated a uniform pigmented retinal pigment epithelium layer without significant detachment from the overlying photoreceptor layer. A bright-field image of the retinal section further demonstrates intact retinal morphology of all layers.