העבודה נתמכה על ידי מענקים מתוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פורץ דרך וקרן סנדלר, מענק March of Dimes מס' 1-FY18-394 ו- 1DP2NS116769-01, פרס החדשנות החדשה של מנהל ה- NIH (DP2NS116769) ל- F.F. והמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R01DK121169) ל- F.F., H.M. נתמך על ידי מלגת הפוסט-דוקטורט של קרן לארי ל. הילבלום, מלגת NIH T32-DK007418 ותוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פורץ דרך מלגת פוסט-דוקטורט עצמאית.

1. הכנת מדיה
הערה: הריכוזים המוזכרים לאורך הפרוטוקול הם ריכוזים סופיים של רכיבי המדיה. הכינו את כל המדיה בתנאים סטריליים במכסה מנוע של זרימה למינרית, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C בחושך. יש להשתמש תוך שבועיים.
<ol><li>אמצעי תחזוקה hPSC: יש לערבב תוסף בינוני לתחזוקת hPSC ללא מזין (20 מיקרוליטר/מ"ל) עם מדיום הבסיס שלו.</li>
	<li>בינוני A: הוסף חלבון מורפוגנטי עצם 4 (BMP4; 1 ננוגרם/מ"ל), SB431542 (10 מיקרומטר) ו-CHIR99021 (600 ננומטר) לתווך בסיס התמיינות (Differentiation Base Medium).</li>
	<li>בינוני B: הוסף SB431542 (10 μM) ו- CHIR99021 (1.5 μM) למדיום בסיס התמיינות (differentiation base medium).</li>
	<li>בינוני C: הוסף SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1.5 μM) ו- RA (1 μM) למדיום בסיס בידול.</li>
	<li>Neural crest Complete (NCC) בינוני: הוסף FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), תוסף N2 (10 μL/mL), תוסף B27 (20 μL/mL), תוסף L-גלוטמין (10 μL/mL) ו-MEM NEAAs (10 μL/mL) למדיום הנוירו-בסיסי.</li>
	<li>ENC Medium: הוסף GDNF (10 ng/mL), חומצה אסקורבית (100 μM), תוסף N2 (10 μL/mL), תוסף B27 (20 μL/mL), תוסף L-גלוטמין (10 μL/mL) ו-MEM NEAAs (10 μL/mL) למדיום נוירו-בסיסי.</li>
	<li>חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) 1x: לדלל 500 mM EDTA (1000x) לריכוז סופי של 500 מיקרומטר ב- PBS. הערה: השתמש ב- PBS בחינם Ca2+ ו- Mg2+ לאורך פרוטוקול זה, אלא אם צוין אחרת.</li>
</ol>2. ציפוי צלחות תרבות
<ol><li>לוחות מצופים מטריצת ממברנת מרתף: הפשירו במהירות, ודיללו אליקוט קפוא של 500 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף ב 50 מ"ל של DMEM מקורר:F12 על ידי פיפטציה נמרצת באמצעות פיפטה סרולוגית 50 מ"ל. מצפים את הבארות בתמיסת מטריצת קרום מרתף מדוללת (100 מיקרוליטר לס"מ2 משטח הבאר) ודגרים עליהם למשך הלילה ב -37 מעלות צלזיוס. יש לשאוף את מצע הציפוי לפני השימוש. כדי למנוע ג'לטיניזציה של מטריצת קרום המרתף, בצע שלב זה מהר ככל האפשר והשתמש ב- DMEM קר:F12 להמסת aliquot קפוא. הערה: טמפרטורת מטריצת קרום המרתף צריכה להישמר קרה במהלך הפשרה (על קרח) ו aliquoting (צינורות על קרח) כדי למנוע קרישה.</li>
	<li>לוחות מצופים PO/FN/למינין: הכינו תמיסת פוליאורניתין (PO) של 15 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS על ידי דילול ציר פי 1000. מצפים בארות עם 100 μL של תמיסת PO / PBS לכל ס"מ 2 של שטח הפנים של הבאר ולדגור את הלוחות לילה ב 37 ° C. למחרת, שאפו PO/PBS וציפו את הבארות ב-100 מיקרוליטר לסמ"ר2 משטח הפנים של הבאר בתמיסת FN/למינין/PBS טרייה המכילה 2 מיקרוגרם/מ"ל פיברונקטין (FN) ו-2 מיקרוגרם/מ"ל למינין. צלחות ניתן להשתמש לאחר מינימום של 2 שעות דגירה ב 37 ° C. יש לשאוף FN/למינין/PBS לפני השימוש.</li>
</ol>3. תחזוקה של תרבות hPSC
הערה: כל שלבי הדגירה של התאים הם ב-5% CO2 וב-37°C באינקובטור לח.
<ol><li>יש לשאוף מדיום hPSC מתרבית hPSC ולהוסיף מדיום טרי (200 μL לס"מ2 משטח פני הבאר) כל יומיים עד שהמושבות יהיו ~80% מתמזגות.</li>
	<li>כדי לעבור, לשאוף hPSC בינוני ולשטוף תאים עם 100 μL של PBS לכל ס"מ2 של שטח הפנים היטב. הערה: חשוב להשתמש ב- PBS חינם Ca2+ ו- Mg2+ כדי לשטוף את התאים.</li>
	<li>הוסף 500 μM EDTA (100 μL לכל ס"מ2 של שטח הפנים היטב). החלף את מכסה הצלחת. צפו דרך מיקרוסקופ הפוך ועקבו אחר ניתוק התאים מקצוות המושבה (2-4 דקות).</li>
	<li>השתמש פיפטה סרולוגית 5 או 10 מ"ל כדי להעביר את אותו נפח של תווך hPSC לתוך כל באר ולקצור מכנית את התאים על ידי pipeting למעלה ולמטה כמה פעמים. הערה: זמן הדגירה האופטימלי של EDTA תלוי בקו iPSC. הימנע pipetting נמרץ עבור ניתוק מושבות כפי שהוא יכול להוביל דיסוציאציה מוגזמת מושבה מוות תאים. כאשר עוברים כדי להתחיל צלחת התמיינות, לדגור על תאים עם EDTA במשך 1-2 דקות יותר.</li>
	<li>מעבירים את תרחיף התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. סובבו את התאים (2 דקות, 290 x גרם, 20-25 מעלות צלזיוס) והשליכו בזהירות את הסופרנטנט.</li>
	<li>להשהות מחדש את התאים בנפח מתאים של מדיום hPSC ולהעביר לבארות של צלחת מטריצת ממברנה חדשה במרתף. הערה: עבור תחזוקה שוטפת של hPSC השתמש ביחס מעבר של 1:18 - 1:24 (1:18 פירושו העברת שליש מהתאים שנותקו מבאר אחת של צלחת בת 6 בארות לצלחת חדשה מלאה). כדי להתחיל לוחית בידול, בצע יחס מעבר של 5:6.</li>
	<li>יש לדגור ב-5%CO2 וב-37°C.</li>
</ol>4. אינדוקציה עצבית
הערה: שלב זה מיוצג באופן סכמטי באיור 1A. התחל התמיינות NC כאשר התאים נמצאים בערך 80% במפגש. זה יושג תוך 1-2 ימים כאשר תאים עוברים ביחס של 5:6 (ראה לעיל). התחל התמיינות NC ביום 0 עם תאי hPSC פלוריפוטנטיים ובלתי ממוינים לחלוטין. לקבלת יעילות גבוהה, גבולות המושבה צריכים להיות בעלי תאים מתמיינים מינימליים. מעבר ולוח hPSC להתמיינות כאשר המושבות גדולות, או מרכז המושבה מתחיל להתעבות/להתכהות כאשר מנוטרים באמצעות מיקרוסקופ הפוך. תשומת לב למפגש ולמורפולוגיה נוטה להיות אמינה יותר ממספר התאים המצופים מכיוון שזה עשוי להשתנות בהתאם לקו התא ויכול לנוע בין 50,000-200,000 לסמ"ר2.
<ol><li>ביום 0, החלף את אמצעי התחזוקה hPSC במדיום A המכיל 1 ננוגרם/מ"ל BMP4, 10 מיקרומטר SB431542, 600 ננומטר CHIR99021 (200 מיקרוליטר בינוני לס"מ2 משטח הבאר).</li>
	<li>ביום השני, התאים צריכים להיות 100% חופפים. לשאוף בעדינות מדיום A ולהזין תאים עם מדיום B המכיל 10 מיקרומטר SB431542, 1.5 מיקרומטר CHIR99021 (200 מיקרוליטר של בינוני לכל ס"מ2 של שטח פני הבאר). הערה: כאשר תרביות גדלות במהלך השראת NC, תאים עשויים להתנתק מהחד-שכבה הבסיסית. הימנע מאובדן תאים עודף על ידי הסרה עדינה של מדיה ישנה והוספת מדיה טרייה לצד הבאר.</li>
	<li>ביום הרביעי, הזינו שוב תאים עם מדיום B (200 מיקרוליטר בינוני לס"מ 2 משטח הבאר).</li>
	<li>ביום 6, החלף את מדיום B בבינוני C המכיל 10 μM SB431542, 1.5 μM CHIR99021 ו- 1 μM חומצה רטינואית (400 μL של בינוני לכל ס"מ 2 של שטח פנים הבאר).</li>
	<li>בימים 8 ו-10, יש להאכיל כמו ביום 6.</li>
</ol>5. היווצרות ספרואידים ENC
הערה: שלב זה מיוצג באופן סכמטי באיור 1B.
<ol><li>ביום ה-12, יש לשאוף בעדינות מדיום C ולשטוף תאים עם 100 מיקרוליטר PBS לס"מ2 משטח הבאר. הוסף את אותו נפח של תמיסת ניתוק תאים ודגור במשך 30 דקות ב 5% CO2 ו 37 ° C.</li>
	<li>לדלל את תמיסת ניתוק התאים על-ידי הוספת נפח זהה של מדיום NCC המכיל 10 ננוגרם/מ"ל FGF2, CHIR99021 3 מיקרומטר, תוספת N2 של 10 מיקרוליטר/מ"ל, תוספת B27 של 20 מיקרוליטר/מ"ל, תוספת L-גלוטמין של 10 מיקרוליטר/מ"ל ו-10 מיקרוליטר/מ"ל מם NEAA. באמצעות פיפטה סרולוגית קוצרים את התרחיף החד-תאי ומוסיפים אותו לצינור חרוטי בנפח 15 מ"ל.</li>
	<li>סובבו את התאים (2 דקות, 290 x גרם, 20-25 מעלות צלזיוס) והשליכו בזהירות את הסופרנטנט.</li>
	<li>באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף 12 מ"ל (לצלחת מלאה של 6 בארות) של מדיום NCC והשהה מחדש את התאים לחלוטין על ידי צנרת מכנית למעלה ולמטה 1-2 פעמים. העבירו את מתלה התא ללוחית חיבור נמוכה במיוחד. הערה: כ-10 ס"מ2 של תאים חד-שכבתיים מסוג ENC מרחפים מחדש ב-2 מ"ל של תווך NCC ומועברים לבאר אחת של לוחית חיבור נמוכה במיוחד. זה שווה ללוחית אינדוקציה NC מלאה של 6 בארות המועברת לצלחת חיבור מלאה של 6 בארות נמוכה במיוחד.</li>
	<li>ביום ה-14, מערבלים בעדינות את הצלחות עד שבמרכז כל באר נאספים כדוריות קטנות. באמצעות מיקרופיפטה P1000 ובתנועה מעגלית איטית, שואפים את תווך NCC המשומש סביב היקף כל באר. נסו להימנע מהסרת הספרואידים הצפים בחופשיות.</li>
	<li>הזן את התאים בנפח המקורי של מדיום NCC.</li>
</ol>6. אינדוקציה EN
הערה: שלב זה מיוצג באופן סכמטי באיור 1B.
<ol><li>ביום ה-15, יש ליישם את אותה טכניקה המשמשת ביום ה-14 כדי להסיר בעדינות את המדיום ולשטוף את הספרואידים עם PBS. הסר PBS ככל האפשר הימנעות הספרואידים.</li>
	<li>הוסף תמיסת ניתוק תאים (100 μL לכל ס"מ2 של שטח הפנים היטב) ולנתק את הספרואידים לתאים בודדים על ידי דגירה במשך 30 דקות ב 5% CO2 ו 37 ° C.</li>
	<li>באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף נפח שווה של מדיום ENC (המכיל 10 ng/mL GDNF, 100 μM חומצה אסקורבית, תוסף 10 μL/mL N2, תוסף B27 20 μL/mL, תוסף L-גלוטמין 10 μL/mL ו-10 μL/mL MEM NEAA בתווך נוירובזאלי) לכל באר ושבור את הספרואידים הנותרים על ידי 2-3 סיבובים של צנרת מכנית. מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. הערה: הימנעו ממתח מוגזם ומוות תאי שיכולים להתרחש כתוצאה מפיפטים כפויים או שימוש בפיפטות עם פתח קצה קטן יותר.</li>
	<li>סובבו את התאים (2 דקות, 290 x גרם, 20-25 מעלות צלזיוס) והשליכו בזהירות את הסופרנטנט. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל, הוסף ~ 5-10 מ"ל של מדיום ENC והשהה מחדש את התאים לחלוטין על ידי פיפטציה למעלה ולמטה 1-2 פעמים.</li>
	<li>ספרו את ריכוז התאים בני קיימא באמצעות טריפאן כחול ושיטת ספירת תאים כגון המוציטומטר. זהירות: טריפאן כחול הוא חומר החשוד כמסרטן. טפל בזהירות, השליך כראוי.</li>
	<li>הוסף נפח מספיק של תווך ENC במטרה לצפות כ 300,000-400,000 תאים קיימא לכל ס"מ 2 של שטח הפנים בצפיפות של כ ~ 1,000,000 תאים למ"ל. שאפו לתמיסת FN/למינין/PBS מבארות הצלחת. הערה: בחר את פורמט הלוח בהתאם לבדיקות המתוכננות עבור תרביות EN מכיוון ששלב זה מסמן את שלב הציפוי מחדש הסופי של הפרוטוקול. אבות נוירון אנטרי ניתן להקפיא ביום 15. לאחר ניתוק הכדורים עם תמיסת ניתוק תאים, השהה מחדש את האבות בערך 5 x 106 תאים / מ"ל בתווך הקפאה כגון 10% DMSO או Stem-cellbanker. בעת הצורך, יש להפשיר במדיית ENC חמה עם מעכב ROCK Y-27632 בגודל 5 מיקרומטר. תאי צלחת בפורמט הצלחת הרצוי. החלף את המדיה ב- ENC טרי לאחר מספר שעות.</li>
	<li>הוסיפו בעדינות את התאים לבארות מצופות PO/FN/למינין. הימנע מבועות שנלכדות מתחת לתרחיף התא ומונעות חיבור תאים לציפוי PO/FN/למינין, במיוחד בעת שימוש בצלחות עם גודל באר קטן יותר כגון לוחות 384 בארות. זה עלול להוביל למוות תאי.</li>
	<li>תאי הזנה אחת ליומיים עם מדיום ENC (200 מיקרוליטר לסמ"ר2 משטח באר) עד יום 30-40, ולאחר מכן להפחית את תדירות ההזנה (לפעם או פעמיים בשבוע) אך להכפיל את נפח ההזנה (ל 400 מיקרוליטר של בינוני לכל ס"מ2 של שטח פני הבאר). הערה: זה חשוב מכיוון שהסרה והוספה מוגזמות של מדיה יכולות להקל על ניתוק התרבית העצבית מפני השטח של הבארות. כדי למנוע ניתוק באופן פרוספקטיבי, במיוחד עבור תרביות לטווח ארוך, יש להוסיף ל-ENC FN (2 מיקרוגרם/מ"ל) ולמינין (2 מיקרוגרם/מ"ל) פעם בשבוע.</li>
</ol>

גזירה של נוירונים אנטריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

<ol>
	<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system:+a+second+brain.">The enteric nervous system: a second brain.</a> Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).</li><li>Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+drug+discovery+for+neuropsychiatric+disorders+using+patient-specific+stem+cell+models.">Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models.</a> Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).</li><li>Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells:+a+tool+for+modeling+Parkinson's+disease.">Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson's disease.</a> Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).</li><li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).</li><li>Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest:+The+fourth+germ+layer.">Neural crest: The fourth germ layer.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).</li><li>Crane, J. F., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+and+progenitor+cells.">Neural crest stem and progenitor cells.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).</li><li>Thomas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neural+crest+cells+display+molecular+and+phenotypic+hallmarks+of+stem+cells.">Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells.</a> Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).</li><li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung's+disease:+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies.">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).</li><li>Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+neural+crest+induction,+melanocyte+specification,+and+disease-related+pigmentation+defects+in+hESCs+and+patient-specific+iPSCs.">Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs.</a> Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).</li><li>Fattahi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+human+ENS+lineages+for+cell+therapy+and+drug+discovery+in+Hirschsprung+disease.">Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease.</a> Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).</li><li>Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+enteric+neuron+lineages+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+transplantation+of+enteric+neural+crest+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells.</a> Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system.">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nat Med. 23, 49-59 (2017).</li><li>Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox10+mutation+disrupts+neural+crest+development+in+Dom+Hirschsprung+mouse+model.">Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model.</a> Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).</li><li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells.">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).</li><li>Majd, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hPSC-derived+enteric+ganglioids+model+human+ENS+development+and+function.">hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function.</a> BioRxiv. , (2022).</li><li>Majd, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+Schwann+cells+from+hPSCs+enables+disease+modeling+and+drug+discovery+for+diabetic+peripheral+neuropathy.">Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy.</a> Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).</li><li>Samuel, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Schwann+cell+derived+melanocytes+from+hPSCs+identifies+pro-metastatic+factors+in+melanoma.">Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma.</a> BioRxiv. , (2023).</li><li>Richter, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+muscarinic+receptor+signaling+protects+human+enteric+inhibitory+neurons+against+platin+chemotherapy+toxicity.">Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity.</a> BioRxiv. , (2023).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול ההתמיינות המתואר כאן מספק שיטה חזקה במבחנה להשגת תאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) בתוך 30-40 יום (איור 1E) ותאי גליה אנטריים המבטאים חלבון חומצי גליה פיברילרי, GFAP ו-SOX10 בתרביות ישנות יותר (> יום 55)13,14,19,22....

מערכת העצבים האנטרית (ENS) היא המרכיב הגדול ביותר של מערכת העצבים ההיקפית. ה-ENS מכיל יותר מ-400 מיליון תאי עצב הממוקמים במערכת העיכול ושולטים כמעט בכל תפקודיהמעי 1. הבנה מולקולרית של התפתחות ותפקוד ENS ופגמיו בנוירופתיות אנטריות דורשת גישה למקור אמין ואותנטי של נוירונים אנטריים. הגישה לרקמה הראשונית האנושית מוגבלת, ומודלים של בעלי חיים אינם מצליחים לשחזר פנוטיפים של מחלות מפתח בנוירופתיות אנטריות רבות. טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) הוכחה כמועילה ביותר במתן מקור בלתי מוגבל של סוגי תאים רצויים, במיוחד אלה שקשה לבודד ממקורות ראשוניים 2,3,4,5,6,7. כאן, אנו מספקים פרטים על שיטת מבחנה מדורגת וחזקה להשגת תרביות ENS מ- hPSCs. תרביות hPSC מדרגיות אלה פותחות אפיקים למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות וסינון תרופות בתפוקה גבוהה ויכולות לספק תאים להשתלה לרפואה רגנרטיבית.
שושלות נוירונים אנטריים נגזרות מתאי עצב (NC) העוקבים אחר נתיב ההתפתחות של ENS במהלך האמבריוגנזה. בעוברים, תאי NC מופיעים לאורך השוליים של הצלחת העצבית המתקפלת. הם מתרבים, נודדים ומולידים סוגי תאים רבים ושונים, כולל נוירונים חושיים, תאי Schwann, מלנוציטים, שלד גולגולתי ונוירונים אנטריים וגליה 8,9,10. ההחלטה על גורל התא תלויה באזור הנפרד לאורך הציר הקדמי-אחורי שממנו יוצאים תאי NC, כלומר NC גולגולתי, NC ווגאלי, גזע NC ו-NC סקרלי. ה-ENS מתפתח מתאי NC ואגליים וסקרליים כאשר הראשון שולט באוכלוסיית תאי העצב האנטריים בשל הנדידה הנרחבת לאורך המעי והתיישבות במעיים11.
גזירה של תאי NC מתאי PSC כרוכה בדרך כלל בשילוב של עיכוב SMAD כפול והפעלת מסלול WNT12,13. עד לאחרונה, כל פרוטוקולי האינדוקציה של NC כללו סרום ותוספים אחרים של מוצרים מן החי בתנאי התרבית. מדיה לא מוגדרת כימית לא רק מורידה את יכולת השחזור של אינדוקציה NC, אלא גם מאתגרת מחקרים התפתחותיים מכניסטיים. כדי להתגבר על אתגרים אלה, Barber et al14 פיתחו פרוטוקול אינדוקציה NC תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים כימית ולכן היה יתרון על פני שיטות חלופיות המסתמכות על גורמי החלפת סרום (למשל, KSR)13,14. זה הושג על ידי החלפת מדיה בסיסית ואופטימיזציה של פרוטוקול שהוצג במקור על ידי Fattahi et al כדי להפיק תאי NC אנטריים מ hPSCs. מערכת משופרת זו היא הבסיס לפרוטוקול הבידול hPSC המוצג כאן. זה מתחיל עם אינדוקציה של תאי עצב אנטרי (ENC) בתקופה של 15 יום על ידי אפנון מדויק של BMP, FGF, WNT ו TGFβ איתות בנוסף חומצה רטינואית (RA). לאחר מכן אנו גוזרים את שושלות ENS על ידי טיפול בתאים עם גורם נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF). כל הרכבי המדיה מוגדרים כימית ומניבים תרביות עצביות אנטריות חזקות תוך 30-40 יום.
בנוסף למערכת תרבית התאים החד-שכבתית המתוארת כאן, פותחו גישות אינדוקציה חלופיות של NC המשתמשות בגופי עובר צפים חופשיים15,16. תאים נודדים בתרביות אלה הוכחו כמבטאים סמני NC עם תת-קבוצה המייצגת את NC הווגאלי. תרביות משותפות עם רקמת מעיים ראשונית שימשו להעשרת מבשרי NC אנטריים בתרבויות אלה. הרכבי המדיה במחקרים אלה מכילים שילוב של גורמים שונים כגון גורם גדילה עצבי, NT3 וגורם נוירוטרופי מוחי. בשלב זה, לא ברור לחלוטין כיצד גורמים אלה עשויים להשפיע על זהויות המחויבות של מבשר הנוירון האנטרית. להשוואה יעילה של השראת NC אנטרית בתרביות החד-שכבתיות ובתרביות מבוססות גוף עובר, נדרשים נתונים נוספים. בהתחשב בפריסות התרבות השונות באסטרטגיות אלה, יש לשקול את השימוש בכל שיטה ולייעל אותה בהתאם ליישום ספציפי בחשבון.
הפרוטוקול המוצג כאן ניתן לשחזור ונבדק בהצלחה על ידינו ועל ידי אחרים באמצעות קווי hPSC שונים (מושרית ועוברית) 8,14,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (serum free, minus vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix, Geltrex</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A14133-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, model no. 5810R</td>
			<td>02262501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell detachment solution, Accutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>07920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1475-0511, 1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differentiation base medium, Essential 6</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 no glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT-46034CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human pluripotent stem cells, H9 ESC</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>RRID: CVCL_1240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with controlled humidity, temperature and CO2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Herralcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1300 series class II, type A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3400-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement, Glutagro</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-015-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAAs</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell plates, Falcon</td>
			<td>BD</td>
			<td>353934, 353075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>CTS</td>
			<td>A1370701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca and Mg free)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette filler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z768715-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-11E, 13-678-11F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of enteric nervous system lineages from human pluripotent stem cells

מערכת העצבים האנטרית האנושית, ENS, היא רשת גדולה של סוגי תאי גלייה ותאי עצב עם מגוון נוירוטרנסמיטרים מדהים. מערכת ENS שולטת בתנועתיות המעי, בהפרשת אנזימים ובספיגת אבות מזון, ומקיימת אינטראקציה עם מערכת החיסון ועם מיקרוביום המעי. כתוצאה מכך, פגמים התפתחותיים ונרכשים של ENS אחראים למחלות אנושיות רבות ועשויים לתרום לסימפטומים של מחלת פרקינסון. מגבלות במערכות מודל של בעלי חיים וגישה לרקמות ראשוניות מציבות אתגרים ניסיוניים משמעותיים במחקרים של ENS אנושי. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט לגזירה חוץ גופית יעילה של שושלות ENS מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, hPSC, תוך שימוש בתנאי תרבית מוגדרים. הפרוטוקול שלנו מתחיל בהתמיינות מכוונת של hPSCs לתאי פסגה עצבית אנטרית תוך 15 יום ומניב תת-סוגים מגוונים של נוירונים אנטריים פונקציונליים תוך 30 יום. פלטפורמה זו מספקת משאב מדרגי למחקרים התפתחותיים, מידול מחלות, גילוי תרופות ויישומים רגנרטיביים.

The enteric nervous system (ENS) is the largest component of the peripheral nervous system. The ENS contains more than 400 million neurons that are located within the GI tract and control nearly all functions of the gut1. Molecular understanding of the ENS development and function and its defects in enteric neuropathies requires access to a reliable and authentic source of enteric neurons. Access to human primary tissue is limited, and animal models fail to recapitulate key disease phenotypes in many enteric neuropathies. Human pluripotent stem cell (hPSC) technology has proven exceedingly beneficial in providing an unlimited source of desired cell types, especially those that are difficult to isolate from primary sources2,3,4,5,6,7. Here, we provide details of a stepwise and robust in vitro method to obtain ENS cultures from hPSCs. These scalable hPSC-derived cultures open avenues for developmental studies, disease modeling, and high-throughput drug screening and can provide transplantable cells for regenerative medicine.
Enteric neuron lineages are derived from neural crest (NC) cells following the ENS developmental path during embryogenesis. In embryos, NC cells emerge along the margins of the folding neural plate. They proliferate, migrate and give rise to many different cell types including sensory neurons, Schwann cells, melanocytes, craniofacial skeleton and enteric neurons and glia8,9,10. The cell fate decision depends on the distinct region along the anterior-posterior axis that the NC cells emerge from, i.e., cranial NC, vagal NC, trunk NC and sacral NC. The ENS develops from vagal and sacral NC cells with the former dominating the population of the enteric neurons owing to the extensive migration along the length of the bowel and colonizing the gut11.
Derivation of NC cells from PSCs commonly involves a combination of dual SMAD inhibition and WNT pathway activation12,13. Until recently, all NC induction protocols involved serum and other animal product additives in the culture conditions. Chemically undefined media not only lower the reproducibility of NC induction but also challenge mechanistic developmental studies. To overcome these challenges, Barber et al14 developed an NC induction protocol using chemically defined culture conditions and was hence advantageous over alternative methods that rely on serum-replacement factors (e.g., KSR)13,14. This was obtained by basal media replacements and optimizing a protocol originally presented by Fattahi et al to derive enteric NC cells from hPSCs. This improved system is the basis of the hPSC differentiation protocol that is presented here. It begins with induction of enteric neural crest (ENC) cells in a 15-day period by precise modulation of BMP, FGF, WNT and TGF&#946; signaling in addition to retinoic acid (RA). We then derive the ENS lineages by treating cells with glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). All media compositions are chemically defined and yield robust enteric neuronal cultures within 30-40 days.
In addition to the monolayer cell culture system described here, alternative NC induction approaches have been developed which use free-floating embryoid-bodies15,16. Migratory cells in these cultures have been shown to express NC markers with a subset representing the vagal NC. Co-cultures with primary gut tissue have been used to enrich enteric NC precursors in these cultures. Media compositions in these studies contain a combination of different factors such as nerve growth factor, NT3 and brain-derived neurotrophic factor. At this stage, it is not fully clear how these factors might affect the enteric neuron precursor commitment identities. For an efficient comparison of the enteric NC induction in the monolayer and the embryoid-body-based cultures more data is required. Given the different culture layouts in these strategies, the use of each method should be considered and optimized according to specific application in mind.
The protocol presented here is reproducible and has been successfully tested by us and others using different hPSC (induced and embryonic) lines8,14,16.

מחבר זרקור: תרבית חזקה של נוירונים אנטריים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

התמיינות של שושלות מערכת העצבים האנטרית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Here we provide a method for generation of human enteric neurons from human pluripotent stem cells under fully defined conditions, and we use these cells in order to understand human enteric nervous system development and function. So I think human enteric nervous system development, physiology and pathophysiology has been a great challenge, and it's because of the rarity of the enteric nervous system cells and the transient nature of the neural crest progenitors, and difficulty in access to tissue and isolation of the tissue. This is a robust platform for generating authentic and functional human enteric neurons from HPSCs, and by overcoming longstanding technical challenges in tissue access, it provides scalable cultures of enteric nervous system components for disease modeling, drug discovery, and studying ENS developments and function.

פרוטוקול זה מספק שיטה להפיק פסגה עצבית אנטרית ותאי עצב אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית (איור 1A-B). יצירת נוירונים באיכות גבוהה תלויה בשלב אינדוקציה יעיל של סמל עצבי אנטרי. ניתן להעריך זאת באופן חזותי על-ידי בדיקת המורפולוגיה של...

הפקת שושלות של מערכת העצבים האנטרית (ENS) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) מספקת מקור מדרגי של תאים לחקר התפתחות ומחלות של ENS, ולשימוש ברפואה רגנרטיבית. כאן, מוצג פרוטוקול מבחנה מפורט להפקת נוירונים אנטריים מתאי גזע גזעיים גזעיים (hPSCs) באמצעות תנאי תרבית המוגדרים כימית.

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls ...

כאן אנו מספקים שיטה ליצירת נוירונים אנטריים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בתנאים מוגדרים במלואם, ואנו משתמשים בתאים אלה על מנת להבין את התפתחותה ותפקודה של מערכת העצבים האנטרית האנושית. אז אני חושב שהתפתחות מערכת העצבים האנטרית האנושית, הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה היו אתגר גדול, וזה בגלל הנדירות של תאי מערכת העצבים האנטרית והאופי הארעי של אבות הפסגה העצבית, והקושי בגישה לרקמה ובבידוד הרקמה. זוהי פלטפורמה חזקה ליצירת נוירונים אנטריים אנושיים אותנטיים ופונקציונליים מ- HPSCs, ועל ידי התגברות על אתגרים טכניים ארוכי שנים בגישה לרקמות, היא מספקת תרביות ניתנות להרחבה של רכיבי מערכת העצבים האנטרית למידול מחלות, גילוי תרופות ולימוד התפתחויות ותפקוד ENS.

differentiation-enteric-nervous-system-lineages-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Differentiation of Enteric Nervous System Lineages from Human Pluripotent Stem Cells

854 Views.  University of California, San Francisco. כאן אנו מספקים שיטה ליצירת נוירונים אנטריים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בתנאים מוגדרים במלואם, ואנו משתמשים בתאים אלה על מנת להבין את התפתחותה ותפקודה של מערכת העצבים האנטרית האנושית. אז אני חושב שהתפתחות מערכת העצבים האנטרית האנושית, הפיזיולוגיה והפתופיזיול?...

Video: מחבר זרקור: תרבית חזקה של נוירונים אנטריים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

The human enteric nervous system, ENS, is a large network of glial and neuronal cell types with remarkable neurotransmitter diversity. The ENS controls bowel motility, enzyme secretion, and nutrient absorption and interacts with the immune system and the gut microbiome. Consequently, developmental and acquired defects of the ENS are responsible for many human diseases and may contribute to symptoms of Parkinson's disease. Limitations in animal model systems and access to primary tissue pose significant experimental challenges in studies of the human ENS. Here, a detailed protocol is presented for effective in vitro derivation of the ENS lineages from human pluripotent stem cells, hPSC, using defined culture conditions. Our protocol begins with directed differentiation of hPSCs to enteric neural crest cells within 15 days and yields diverse subtypes of functional enteric neurons within 30 days. This platform provides a scalable resource for developmental studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative applications.

Deriving enteric nervous system (ENS) lineages from human pluripotent stem cells (hPSC) provides a scalable source of cells to study ENS development and disease, and to use in regenerative medicine. Here, a detailed in vitro protocol to derive enteric neurons from hPSCs using chemically defined culture conditions is presented.

Formation of Neural Crests from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

To induce neural crest formation, replace the maintenance medium of the human pluripotent stem cell culture with 200 microliters of medium A per square centimeter of the well-surface. Incubate the culture under 5%carbon dioxide supplementation at 37 degrees Celsius for two days. Gently aspirate the medium from the well-containing 100%confluence cells then pipette about 200 microliters of medium B per square centimeter of the well-surface area.On day four, feed the cells with 200 microliters of medium B per square centimeter of the well-surface. Incubate the cells for two more days, then replace the medium B with 400 microliters per square centimeter of medium C.

היווצרות פסגות עצביות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לחקר מערכת העצבים האנטרית

Differentiation of Enteric Neural Crest Spheroid and Neuronal Induction from Human Pluripotent Stem Cells for Enteric Nervous System Research

To begin, take 12-day cultures of human pluripotent stem cells that have been subjected to neural crest induction. Gently aspirate medium C from the cells. Add 100 microliters of PBS per square centimeter of well surface area to wash the cells, and then remove the PBS.Add an equal volume of cell detachment solution to the cells and incubate for 30 minutes under 5%carbon dioxide supplementation at 37 degrees Celsius. Add an equal volume of NCC medium into the plate. Then, use a serological pipette to harvest the cell suspension and transfer it to a 15-milliliter conical tube.Spin the cells at 290G for two minutes between 20 to 25 degrees Celsius. Carefully discard the supernatant without disturbing the cell pellet. Use a 10-milliliter serological pipette to pipette 12 milliliters of NCC medium to the cell pellet.Mechanically pipette the suspension up and down to create a suspension. Then, transfer the cell suspension to an ultra low attachment plate. On day 14, gently swirl the cell culture plates to gather small spheroids at the center of each well.Use a P1000 micro pipette to slowly aspirate the spent medium from the circumference of each well. Refeed the cells with the original volume of NCC medium. On day 15, carefully remove the medium.Add PBS to the wells to wash the spheroids. Then, remove as much PBS as possible, ensuring spheroids are not disturbed. Next, add 100 microliters of cell detachment solution per square centimeter of well surface area.Incubate the cells in the solution for 30 minutes under 5%carbon dioxide at 37 degrees Celsius. With a 10-milliliter serological pipette, add an equal volume of ENC medium to each well. Mechanically pipette the solution to break any remaining spheroids.Then transfer the cells to a 50-milliliter conical tube. Discard the supernatant after centrifuging as before. Then, resuspend the cells in 5 to 10 milliliters of ENC medium.Count the concentration of viable cells using trypan blue and hemocytometer. Now, add enough volume of ENC medium to plate about 300, 000 to 400, 000 viable cells per square centimeter of surface area, and a density of about 1 million cells per milliliter. Then, aspirate the solutions from the wells.Next, add the cells to a plate with PO/FN laminin coated wells. Feed cells every other day with 200 microliters of ENC medium per square centimeter of well surface area until days 30 to 40. High quality free floating spheres with smooth surfaces were observed after neural crest induction.The spheroids expressed the neural crest marker SOX10. Neurites were observed between days 25 to 30 during the enteric neuron induction.