מטרת המחקר היא לקדם מודלים מיקרופיזיולוגיים של הלב במבחנה על ידי שילוב שיטות פוטוסטימולציה מבוססות חומרים. הוא מתמקד בהתגברות על מגבלות באריכות ימים ופולשניות לגירוי, מתן כלים אמינים לחקר פיזיולוגיה של הלב, שיפור תהליכי סינון תרופות וטיפוח יישומים במודלים של מחלות. ההתקדמות האחרונה בגירוי ביולוגי ממנפת, כמו בקרה תאית מדויקת ולא פולשנית.
אופטוגנטיקה מאפשרת שינוי גנטי כדי לווסת את הפעילות התאית, בעוד שמתמרים פוטו-מבוססי חומר מתפתחים מציעים חלופות לא גנטיות. חידוש זה מספק פריצת דרך משמעותית במחקר ומווסת נוירונים, קרדיומיוציטים ותאי שריר שלד ביישומים מגוונים. אתגרי הניסוי הנוכחיים כוללים השגת אספקת אור עקבית לרקמות עמוקות, אופטימיזציה של התאימות הביולוגית והיציבות של מתמרים פוטו, ושיפור הדיוק של טכניקות גירוי מבוססות אור.
בנוסף, שילוב שיטות אלה עם מערכות ביולוגיות מורכבות תוך שמירה על כדאיות ופונקציונליות תאית נותר מכשול מרכזי. פרוטוקול זה נותן מענה לפער המחקרי של הצורך בטכניקות גירוי מדויקות לא פולשניות במודלים מיקרופיזיולוגיים של הלב. על ידי שימוש במתמרים פוטו-מבוססי חומרים, כמו Ziapin2, גישה זו מתגברת על המגבלות של גירוי חשמלי מסורתי ואופטוגנטיקה, ומציעה קווי מתאר זמניים ומרחביים משופרים תוך שמירה על כדאיות ותפקוד הרקמות.
הממצאים שלי יקדמו את המחקר על ידי הצגת טכניקת גירוי אור לא פולשנית מבוססת חומרים המציעה דיוק ושליטה גדולים יותר על הפעילות התאית ברקמות הלב. גישה זו מבטלת את הצורך בשינויים גנטיים, ומספקת כלי רב-תכליתי למידול תפקוד הלב, חקר מנגנוני מחלה ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות יעילות יותר. כדי להתחיל, הדביקו שתי שכבות של סרט מעבדה, אחת לבנה ואחת כחולה, ליריעת אקריליק שקופה, עמידה בפני שריטות ואולטרה סגול בעובי מילימטר.
חותכים את תבנית השבב על הקלטת בהתאם לעיצוב המיועד, ואז, בעזרת חרט לייזר פחמן דו חמצני, חותכים את יריעת האקריליק לעיגולים. הסר את שתי שכבות הסרט בתוך הקו הפנימי ביותר בעזרת פינצטה. משרים את הצ'יפס באקונומיקה טהורה למשך 30 דקות עד שעה כדי להסיר קווים עבים וכתמים כהים מהחיתוך, משאירים קו חד, ושוטפים את הצ'יפס בכוס במים זורמים נטולי יונים למשך הלילה או למשך שלוש שעות לפחות.
סוניקציה של השבבים למשך 10 דקות בחותמות הפולידימתילסילוקסן, או PDMS, עם תכונות חריץ קו למשך 30 דקות באתנול נקי של 70%. העבירו את השבבים והחותמות לאזור נקי מתחת למכסה המנוע ותנו להם להתייבש תחת זרימת אוויר למשך כשעה עד שעתיים. לאחר מכן, סוניקציה של הג'לטין הטרי שהוכן למשך 15 דקות, ואז החזירו אותו לאמבט המים של 65 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.
הנח את הטרנסגלוטמינאז המיקרוביאלי, או צינור MTG, בחומר ייבוש כשהמכסה משוחרר מעט והפעל לאט את הוואקום כדי להסיר את הבועות. לאחר הסרת הגז, החזר את צינור ה-MTG לאמבט המים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, כסו יריעת רשת עם פרפילם נקי והניחו את הצ'יפס על הרשת.
שמור את חותמת ה-PDMS בקרבת מקום לשימוש. הוסף חמישה מיליליטר MTG לחמישה מיליליטר מתמיסת הג'לטין, פיפטינג בזהירות כדי למנוע בועות. כעת, יש להוציא במהירות כ-0.5 מיליליטר מתערובת הג'לטין על כל שבב, וודא שהתערובת מכסה את אזור השבב.
הנח את חותמת ה-PDMS בדוגמת קו למעלה והחל משקל של 200 גרם כדי להבטיח שהג'לטין מעוצב במקביל לציר האורך של הרקמה. לאחר שכל השבבים יצוקים, כסו אותם בצנצנת זכוכית כדי למנוע הפרעה סביבתית ואפשרו להם לקשר בן לילה. העבירו את השבב וחותמת ה-PDMS הדחוסים לצלחת P150 חדשה מלאה ב-PBS כדי להרטיב את הג'לטין למשך 30 דקות עד שעה כדי להקל על הפרדת חותמת ה-PDMS מהשבב.
לאחר הסרת כל עודפי הג'לטין סביב השבב, העבירו את הצ'יפס הנקי לכלי P150 חדש מלא ב-PBS. אחסן את חותמות ה-PDMS באתנול 70%. כדי לעקר את הצ'יפס, יש להשרות אותם באתנול למשך 10 דקות מתחת למכסה המנוע.
מעבירים את הצ'יפס ל- PBS, משרים אותם למשך 10 דקות, ולאחר מכן שטיפה שלוש פעמים PBS. עבור תמיסות הציפוי, מערבבים 20 מיקרוגרם למיליליטר פיברונקטין עם דילול של 1 עד 100 של ג'לטרקס במצעי גידול ללא תוסף. מצפים את השבבים בתמיסה זו למשך שעתיים בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
הפשרה וזריעה של קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במדיום RPMI המכיל 10 מיקרו-מולרי Y-27632. החלף את המדיום ב-RPMI נטול Y-27632 לאחר 24 שעות. שלושה ימים לאחר זריעת התאים, השתמש בפינצטה כדי להסיר בזהירות את הסרט הלבן מהשבבים.
הכן את מכשיר המיפוי האופטי המורכב ממיקרוסקופ עדשות טנדם שונה המצויד במצלמה מהירה ומנורת כספית של 200 מיליוואט כמקור אור העירור. הנח מראה דיכרואית מול מצלמת הדמיית הסידן הייעודית. עבור קוצב אופטי, הפעל גירוי נקודתי אופטי בקצה אחד של הרקמה באמצעות מקור אור LED כדי לעורר את Ziapin2, מתמר הפוטו.
קצב את הרקמות בתדר של 0.5, או הרץ אחד, באמצעות סיב אופטי מווסת זמנית הממוקם במרחק של מילימטר אחד מהרקמה. דגרו את הדגימה עם שני מיקרו-מולר X-Rhod-1 שנוספו למדיום התרבות למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת הצ'יפס במדיום תרבית טרי, העבירו אותם למדיום RPMI 1640 נטול פנול אדום, בתוספת B-27 מינוס אינסולין ו-HEPES.
הנח את שבבי הרקמה בצלחת מבוקרת טמפרטורה המוגדרת לטמפרטורה פיזיולוגית והתחל להקליט בקצב פריימים של 2.5 פריימים לשנייה. התפשטות גלי הסידן הודגמה בהצלחה, עם רזולוציה מרחבית וזמנית ברורה במהלך גירוי פוטו בתדרים של 0.5 או 1 הרץ, עם מהירויות הולכה המחושבות כ-4.5 סנטימטרים לשנייה, בהתאם לערכים הפיזיולוגיים. פרמטרים חולפים של סידן, כולל משרעת, זמן עלייה, דעיכה מקסימלית, שיפוע וזמן דעיכה, היו דומים כמותית בין גירוי אור לגירוי חשמלי, ואישרו תגובות תפקודיות דומות.
