אי ספיקת לב היא סיבת המוות המובילה עבור גברים ונשים כאחד בעולם. ראיות חדשות מצביעות על שינוי בחילוף החומרים הלב מערכתי לתרום הפתולוגיה של אי ספיקת לב. לזהות במהירות אילו מטבוליטים משפיעים על צימוד התכווצות ציריות הוא עדיין אתגר.
הגישה המסורתית של בידוד מיוציט לב מעכבר בוגר הוא תהליך זמן רב ומאתגר. השיטה החדשנית במאמר זה הופכת תהליך מחמיר ליעיל וקל יותר לביצוע. כמו כן, באמצעות בדיקה פלואורסצנטי, אנו יכולים לבצע הערכות פנוטיפיות רבות של איך כימיקלים יכולים לגרום רעילות לב או תפקוד לקוי ברמה התאית.
על ידי זיהוי אילו מולקולות לשנות את תפקוד מיוציט, טיפולים חדשים ניתן לזהות לטיפול של אי ספיקת לב. באמצעות עכברים מהו מהודרים, אנו יכולים לחקור גנים שונים כדי לקבוע אילו יכולים למנוע ולתרום לאי ספיקת הלב. מידע זה יהיה חיוני בריפוי עתידי של אי ספיקת לב.
הדגמת ההליך תהיה מתיו קלוס ותלמיד שריאס Suresh. כדי להתחיל, להפשיר את פתרון למינין עובד על קרח. באמצעות פיפטה P1000, שאפו 200 מיקרוליטרים של למינין וגרור בעדינות את קצה הפיפט לאורך קצה אחד של הכיסויים העוקרים כדי לאפשר לפעולה נימית לשלוף כמות זעירה של למינין להקלה על חיבור כיסוי לצלחת שש בארות.
לאחר מכן לגרש את למינין הנותר במרכז הכיסוי בתנועה מעגלית. מורחים את טיפת למינין על פני הכיסוי. מניחים את הכיסויים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות עד 24 שעות לפני הבידוד.
כדי לבודד מיוציטים מלב מוכן ב- KHB-HB קר, מניחים את המדגם תחת מיקרוסקופ סטריאו. כדי למנוע emboli, ראש cannula aortic על ידי שקוע אותו בפתרון KHB-HB ושימוש מזרק 20 מיליליטר כדי לכפות את הפתרון דרך. ודא שהלב שקוע והקנולה מוקרבת לפני כריתת הלב.
עם 5 מדפים, לאכלס את הלב. אשר מיקום תקין של ה cannula על ידי לדמיין את קצה ה Cannula כ מילימטר אחד מעל החדרת עזר לתוך החדר. ואז להתחיל את הזרימה של KHB-HB על ידי סיבוב stopcock על Langendorf.
חבר את ה Cannula ל Langendorf כדי לבלבל את הלב במשך חמש דקות. לאחר מכן, סובב את ה- stopcock כדי להעביר את התבלין ממאגר KHB-HB למאגר מאגר העיכול. לאחר חיץ העיכול מגיע ללב, להגדיר שעון קצב.
לאסוף את perfusate בסקולר סטרילי 100 מיליליטר. מלאו מחדש את מאגר מאגר העיכול לפי הצורך עם התפנית עד שפג תוקפו של זמן העיכול. לאחר העיכול, בסקילר סטרילי של 100 מיליליטר, מפרידים את תאי הלב עם מלקחיים ומספריים של איריס.
מניחים כל תא לתוך באר נפרדת של צלחת שש בארות. יוצקים חמישה מיליליטר של תותב קולגן לתוך כל באר. מיד להשתמש במספריים כדי לטחון את רקמת הלב לגושים של כמטר מעוקב אחד.
באמצעות פיפטה העברה סטרילית, בעדינות triturate רקמת הלב טחון עם חיץ העיכול. לאחר נתחי הרקמה הופכים לבנים ונוצות, מניחים את הצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לבחון את התאים. אם מספר התאים קיימא גדול מ 80%להמשיך לסנן את התאים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר באמצעות מסננת תאים 100 מיקרון.
אם מספר התאים בני-קיימא קטן מ- 80%check הזמן שנדרש לבדיקה. אם זמן ההתכה הוא מעל חמש דקות, נסה לב אחר. אם לא, תזהה חריצי קולגן חדשים דרך תוכנית הדגימה של הקולגנס.
לאחר מכן, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 215 פעמים g במשך שתי דקות. גלולה צריך להיות קומפקטי ולא רופף. אם גלולה הוא רופף, ההכנה מכילה תאים מתים רבים.
במכסה המנוע של תרבות הרקמות, תן שימוש חוזר לכדור הקומפקטי ב-10 מיליליטר של חיץ עצירה. גלולה התאים שוב על ידי צנטריפוגה ב 215 פעמים g במשך שתי דקות. תן שימוש חוזר בתאים בחמישה מיליליטר של חיץ ציפוי.
בצע ספירת תאים על מונה ציטו והתאם את עוצמת הקול של מאגר הציפוי כדי להגיע לריכוז מיוציט סופי של פעמיים 10 לארבעת התאים למיליליטר. עכשיו הסירו את הכיסויים מצופים הלמינין מהאינקובטור. שאף את טיפת למינין אם קיים.
צלחת 200 מיקרוליטרים של השעיית מיוציט על כל כיסוי. מניחים את הכיסויים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 21% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שעתיים כדי לאפשר התקשרות. לאחר שעתיים, מוציאים את הכיסויים ושופסים את התאים הלא מחוברים.
הוסיפו שני מיליליטר של תרבות ותרבות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס עד ארבעה ימים. ראשית, הסר את רכיב A ורכיב B מהערכות הפוטנציאליות של הממברנה. בצינור חרוט 15 מיליליטר, לשלב 50 microliters של רכיב B וחמישה microliters של רכיב A כדי ליצור תערובת צבע מתח.
וורטקס לערבב. הוסף 10 מיליליטר של ציפוי מדיה לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל את תערובת צבע המתח כדי ליצור את תערובת צבע פוטנציאלי קרום. שוב, מערבולת לערבב.
ואז להסיר צלחת אחת שש בארות של מיוציטים מהאינקובטור. שאף את התקשורת. מוסיפים 800 מיקרוליטרים של תערובת הצבע הפוטנציאלית של הממברנה לכל באר.
מכסים את הצלחת בנייר כסף ומשאירים את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר מכן, שאפו את תערובת המדיה לצבוע מכל באר והוסיפו מיליליטר אחד של הפתרון של טירודה שונה לכל באר. מכסים בנייר כסף.
הפעל את הציוד בסדר של מיקרוסקופ, מנורת קשת, HyperSwitch, מערכת ממשק פלואורסצנטי, ספק כוח MyoCam, ממריץ שדה, ומחשב. ודא שערכות מסנן פליטת העירור מתאימות לצבע ההדמיה. לדוגמה, fura-2 הוא נרגש ב 340 ננומטר ו 380 ננומטר של אור.
הוא פולט 510 ננומטר של אור. Fluo-4 וצבע קרום המתח נרגשים ב 485 ננומטר של אור פולטים ב 520 ננומטר של אור. ראש מערכת ההקלטה על ידי הפעלת ואקום, פתיחה מלאה של מהדק הצינור, בעדינות צולל כל מזרק 60 מיליליטר עם הפתרון של טירוד בסעפת.
להקלטות סידן, השתמש בתסמת תקן של טירודה. להקלטות מתח, השתמש בתסרון של טירוד שהשתנה. הפעל את תנור הקו.
לשמור על הטמפרטורה כך perfusate בתא הוא ב 36 פלוס או מינוס מעלות צלזיוס אחת לפחות 15 דקות. לאחר מכן, פתח את תוכנת הרכישה. ודאו שהפרמטרים מוגדרים לצבע ההדמיה הנכון.
תכבה את המריצה. בחושך, להסיר את נייר הכסף מן הצלחת שש בארות ולה מניחים כיסוי בתא ההליכה. מניחים את הלוח תחת מיקרוסקופ ולהתמקד מיוציטים באמצעות המטרה 10X.
לאחר ההתמקדות, להתחיל לצעוד על ידי שדה מגרה אחד הרץ ו 0.2 וולט. הגדל בהדרגה את המתח עד שתתקבל צעד אחד לאחד. לאחר מכן להגדיל את המתח עד 1.5 פעמים הסף הוא הגיע.
עבור מהמטרה 10X למטרה 40X. התמקד בתא הבא בעקבות צעד אחד לאחד. כוונן את גווני הפלסטיק כך שרק תא אחד יהיה בשדה התצוגה.
באמצעות התוכנה, למקם את האזור של תיבת עניין על סרקומרים מוגדרים היטב. הפעל את תוכנת הרכישה כדי ליזום את אור העירור. בעזרת מסנני הצפיפות הניטרלית, התאימו את הגדרת העוצמה בהתאם כדי לקבל יחס אות לרעש הולם.
כאן מוצגים עקבות קיצור הסידן והסרקום הייצוגיות שנרשמו ממיוציטים של עכברים C57BL/6 באמצעות fura-2. כימות של נתונים ממוצעים של ההרכב שהתקבלו מעכברי C57BL/6 לבין חברי המלטה המהופנטים שלהם לא מראה שום הבדל בין הקבוצות למעט זמן הרפיה ב 10 צעדים הרץ. מעקב המתח נרשם מעכבר C57BL/6 myocyte עכבר בקצב של 10 הרץ היה פוסט מעובד כדי לקבל אות שמיש.
ההרכב העמיד ממוצע של פוטנציאל פעולה לאחר מעבר נמוך של באטרוורת' או מסנן דיגיטלי של Savitzky-Golay שהוחל כדי להראות הבדלים עדינים בצורת פוטנציאל הפעולה. העקבות שנרשמו ממיוציטים של חולדות בקצב אחד של הרץ מראים בנוסף לכך שסימן המתח נמוך יותר מאות הסידן, גם הקינטיקה של ההתכווצות שונה. הסיבה לכך היא סידן צבעים חיץ סידן בעוד צבעי מתח לא.
כמו עם סידן חולף, מיוציטים הפגינו שינויים תלויים צעדים משך הפעולה האופטית שלהם פוטנציאל. הארכה הנגרמת על ידי סמים של פוטנציאל הפעולה הוכח גם כן. 11 השניות האחרונות של הקלטה של 20 שניות הצביעו על כך שחשיפה ממושכת של מיוציטים לאור כחול מובילה לפעילות מופעלת.
בעת ניסיון הליך זה, הדבר החשוב ביותר לזכור הוא להשתמש באור בעוצמה הנמוכה ביותר האפשרית, כך שאתה לא נזק myocytes. מיוציט מבודד באמצעות הגישה שלנו יכול לשמש גם עבור אימונוהיסטוכימיה או שנערך לניתוח כתם מערבי. היופי של טכניקה זו, זה מאפשר לחוקרים להעריך במהירות כיצד מגוון של מולקולות וגנים לעזור צימוד צירציה-התכווצות באמצעות מערכת אחת.
