האדם מחקרים בתאי גזע עובריים במעבדה Teitell נתמכים כיום על ידי המכון לרפואה בקליפורניה הרגנרציה (CIRM) זרע מענק RS1-00313. אנו מודים לד&quot;ר קרלה קוהלר (UCLA) ואנשי מעבדה קוהלר למתן עצות ותובנות אלה ומחקרים נוספים.

רזולוציה גבוהה נקה Native ג&#39;ל Electophoresis (hrCNE) עבור קומפלקס מיטוכונדריאלי In-Gel פעילות מבחני בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נשמרו על monolayer של C-שטופלו fibroblasts ˠ מוקרן או mitomycin עכבר עובריים (MEFs), אחר כך עברו על צמיחה Matrigel במשך 5 ימים במדיום MEF ממוזג באמצעות תנאים סטנדרטיים. כדי להסיר זיהום MEFs, hESCs היו מחדש מצופה על Matrigel גדל במדיום MEF ממוזג עבור 3 ימים נוספים. מיקרוסקופיה immunofluorescence עבור סמנים pluripotency אוקטובר-4 ו SSEA-4 שימש כדי לאשר את חוסר בידול hESC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם תאים חמים 1x PBS, pH 7.4, ואחריו trypsinization (1ml של 1x טריפסין היטב לכל צלחת 6-באר) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של מעכבי טריפסין טריים (ב 1mg/ml 1x PBS, pH 7.4). קציר תאים צנטריפוגות ב 200 גרם, 5 דקות, בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את התאים pelleted supernatant ו resuspend ב 0.8 - 1.7ml (מבוסס על גודל תא גלולה) של קרח קר חיץ בידוד המיטוכונדריה (83mM סוכרוז; 6.6mM imidazole / HCl, pH 7.0) עם המוכן טרי קוקטייל &quot;מעכבי פרוטאז 1. לדגור על הקרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dounce תאים עם homogenizer (~ 40-50 משיכות). הכתם aliquot של תאים dounced עם trypan כחול כדי לבדוק השלמות של homogenization באמצעות מיקרוסקופ אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 20,000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להשיג גולמי המיטוכונדריה גלולה שמכיל גם גרעינים ושברי תאים גדולים יותר. למזוג וזורקים supernatant ולשקול גולמי זירז המיטוכונדריה גלולה. גלולה יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C בעקבות הקפאה מיידית של חנקן נוזלי אם זו נקודת עצירה. הערה: צנטריפוגה דיפרנציאלי או שיפוע מבוססי הליכים יכול לשמש לבידוד איסוף חלק טהור קרום המיטוכונדריה. ראו נ&quot;צ. 4 לקבלת פרטים. גישה חלופית זו תניב את פעילות המיטוכונדריה מורכבים לכל מיליגרם של חלבון המיטוכונדריה במקום פעילות מורכבת לכל מיליגרם של משקל תא או מספר תאים. ריכוז של חלבונים במיטוכונדריה יהיה צורך נקבע לאחר טיהור לעשות את ההשוואה הזאת. כמו כן, חיץ בידוד שונים עשויים להידרש לגישה זו. עבור solubilization של חלק קרום טהור המיטוכונדריה, ראה את ההערה הבאה לשלב 6 למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize הגולמי המיטוכונדריה גלולה על הקרח ידי vortexing עם חיץ קרים solubilization (NaCl 50mm, 50mm imidazole / HCl pH 7.0, 1mm EDTA, 2mm 6-aminohexanoic חומצה). חומצה 6-aminohexanoic יכול להיות מוחלף עם קוקטייל מעכבי פרוטאז 1x. השתמש 35μl של חיץ solubilization לכל 20mg משקל גלולה. הוסף 20μl של 10% w / v digitonin לכל 20mg משקל גלולה ומערבבים ידי מצליף את הצינורית. דגירה של 50-10 דקות על הקרח. Dodecyl-BD-maltoside או טריטון X-100 ניתן להחליף digitonin כדי solubilize את החלבונים. הבחירה של חומר ניקוי וכמותו עלול להשפיע על היווצרות supercomplexes או צורות multimeric של קומפלקסים המיטוכונדריה. לקבלת מידע נוסף, ראה ref.1. הערה: כמות של חומר הניקוי הנדרש solubilize שבריר טהור קרום המיטוכונדריה המתאים יחס כביסה / חלבון משקל החל 2-6g / g. יחס אופטימלי solubilize ממברנות המיטוכונדריה היא 2.5G / g dodecyl-BD-maltoside, 3G / g טריטון X-100, ו - 6 גרם / g digitonin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה גלולה solubilized ב 100.000 גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C. אסוף את supernatant ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טעינה חיץ גליצרול הסופי w / v 5% ו 0.01% w / v Ponceau S (שימוש של 50% w / v גליצרול, 0.1% w / v החיץ טעינה S Ponceau פתרון המלאי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען בארות ג&#39;ל עם נפח המכיל 20-40 מג של המיטוכונדריה גולמי גלולה לכל נתיב. השתמש שיפוע acrylamide ג&#39;ל (4 -13%) עם 3.5% לערום ג&#39;ל. הערה: הכנת ג&#39;ל אלקטרופורזה ותנאים: להכנת ג&#39;ל, השתמש acrylamide / bis-acrylamide (AA / bisAA) 3 לערבב כדלקמן: 48g של acrylamide ו 1.5g של bisacrylamide (49.5% T, 3% ג T איפה הוא ריכוז מוחלט של AA ו bisAA ו-C הוא אחוז crosslinker (bisAA) כדי מונומר סה&quot;כ). ג&#39;ל חיץ (3 &#39;): 6-1.5M aminohexanoic חומצה; imidazole 75mm, pH 7.0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><td> צבע ג&#39;ל: </td><td> 4% </td><td> 13% </td><td> הערמה ג&#39;ל: </td><td> 3.5% </td></tr><tr><td> AA / bisAA לערבב 3 </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 6.5 מ&quot;ל </td><td></td><td> 0.6 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ג&#39;ל חיץ 3 &quot; </td><td> 8.3 מ&quot;ל </td><td> 8.3 מ&quot;ל </td><td></td><td> 2.7 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td></td><td> 5 גרם </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14.7 מ&quot;ל </td><td> 5 מ&quot;ל </td><td></td><td> 4.7 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סך נפח </td><td> 25 מ&quot;ל </td><td> 25 מ&quot;ל </td><td></td><td> 8 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 10% APS </td><td> 139 μl </td><td> 125 μl </td><td></td><td> 67 μl </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 μl </td><td> 12.5 μl </td><td></td><td> 6.7 μl </td></tr></tbody></table> חיץ האנודה: 25mm imidazole / HCl, pH 7.0 חיץ קטודה: Tricine 50mm, 7.5mM imidazole / HCl, 0.02% w / v dodecyl-BD-maltoside, 0.05% w / v deoxycholate, pH 7.0 יוצקים ולהפעיל ג&#39;לים בחדר קר (4-7 מעלות צלזיוס). המתח הראשוני נעשה שימוש הוא 100V. כאשר המדגם נכנס ג&#39;ל הערמה, המתח עולה עד 500V עם מוגבלות הנוכחית 15mA (0.15 עבור &quot;14&quot; 14 ס&quot;מ ג&#39;ל). אלקטרופורזה היא נעצרה לאחר 3-4 שעות, כאשר קו חד של צבע אדום Ponceau S גישות הקדמי ג&#39;ל. לחלופין, ג&#39;ל ניתן להפעיל ולינה 70-100V עם מתח קבוע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> In-ג&#39;ל פעילות מבחני. זמן הדגירה של assay כל תלוי היעילות של solubilization חלבון כמות החומר טעון בכל טוב. תסביכים אני, IV ו-V בדרך כלל תשואה אותות חזקים יותר מתחמי II ו-III. </li></ol> אני קומפלקס (CI) דגירה את הפרוסה עם ג&#39;ל CI חיץ (5mm טריס-HCl, pH 7.4, 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. CI חיץ: הוסף לכל 100 מ&quot;ל של 5mm טריס-HCl, pH 7.4: 0.01g NADH 0.25g NBT תקן את ג&#39;ל מתנול 50% חומצה אצטית 10% דק &#39;15-45. הג&#39;ל קבוע נשמרת חומצה אצטית 10%. קומפלקס II (כת&quot;ש) דגירה את הפרוסה עם ג&#39;ל CII חיץ (נתרן 20mm succinate; methasulfate phenazine 0.2mM; 2.5mg/ml NBT, 5mm טריס-HCl pH 7.4) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. כת&quot;ש חיץ: הוסף לכל 100 מ&quot;ל של 5mm טריס-HCl, pH 7.4: 200μl נתרן 1M succinate 80μl methasulfate phenazine (PMS 250mm מומס DMSO) 0.25g NBT תקן את ג&#39;ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני קומפלקס III (CIII) דגירה את הפרוסה עם ג&#39;ל CIII חיץ (סודיום פוספט 50mm, pH 7.2, 0.05% 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. CIII חיץ: הוסף לכל 100 מ&quot;ל של pH נתרן פוספט, 50mm 7.2: 50 מ&quot;ג tetrahydrochloride diaminobenzidine תקן את ג&#39;ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני קומפלקס IV (CIV) דגירה את הפרוסה עם ג&#39;ל CIV חיץ (סודיום פוספט 50mm, pH 7.2, 0.05% 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), לב 50μM סוס ציטוכרום c) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. CIV חיץ: הוסף לכל 100 מ&quot;ל של pH נתרן פוספט, 50mm 7.2: 50 מ&quot;ג tetrahydrochloride diaminobenzidine לב 0.1g סוס ציטוכרום c תקן את ג&#39;ל כפי שתואר עבור קומפלקס אני קומפלקס V (CV) דגירה הפרוסה ג&#39;ל עם קורות חיים חיץ (35mm טריס בסיס, גליצין 270mM, pH 8.3 במהירות של 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0.2% w / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. קורות חיים למאגר: 100 מ&quot;ל לכל פתרון להוסיף: <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טריס בסיס </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> גליצין </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> Pb (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> אין צורך להתאים את ה-pH (צריך להיות 8.3) - לא להשתמש חומצה או בסיס. סנן ולהוסיף <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ה-ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> תקן את ג&#39;ל מתנול 50% למשך 30 דקות ומעבירים למים.

<ol>
	<li>Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch&#747;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li><li>Wittig, I., Karas, M., Sch&#747;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6.">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li><li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch&#747;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines.">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li><li>Castle, J. D., Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells.">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 4.2, 4.2.1-4.2.57 (2007).</li></ol>

בסרטון הזה, שתיארנו החילוץ של קומפלקסים חלבונים מן המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים, הפרדה שלהם על ידי אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה ברור ג&#39;ל יליד (hrCNE), וכן על ידי ניתוח לאחר מכן ב-ג&#39;ל מבחני פעילות קטליטית. hrCNE פותר המיטוכונדריה חלבון מתחמי ממברנה ברזולוציה דומה לזה של כח?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>0.5M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP120-1</td>
<td>adjust pH to 8.0 with NaOH </td>
</tr>
<tr>
<td>1M NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S3014-500MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Sodium succinate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>S413-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1M Sodium phosphate buffer pH 7.2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP332-1 and BP329-1</td>
<td>Mix 68.4 ml of 1M Na2HPO4 and 31.6 ml of 1M NaH2PO4 to prepare 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.2 at 25 C </td>
</tr>
<tr>
<td>1M Tricine, pH 7.0 (adjusted with NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>9010</td>
<td>store at 4 C </td>
</tr>
<tr>
<td>1M imidazole/HCl, pH 7.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I-2399</td>
<td>store at 4 C</td>
</tr>
<tr>
<td>1M Tris-HCl, pH 7.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP153-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20% (wt/vol) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>44205-500MG</td>
<td>Dissolved in water. Store 1 ml aliquots at &#x2013;20 C.</td>
</tr>
<tr>
<td>10% (wt/vol) digitonin (>50% purity, used without recrystallization)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>37008-1G</td>
<td>Dissolved in water. Store 0.1&#x2013;1 ml aliquots at &#x2013;20 C. Should be warmed up to 95 C before use.</td>
</tr>
<tr>
<td>2M 6-aminohexanoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>07260-100G</td>
<td>store at 4 C</td>
</tr>
<tr>
<td>10x Ponceau S/glycerol stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-3504 and G6279-1L</td>
<td>0.1% Ponceau S, 50% glycerol, (wt/vol) in water.</td>
</tr>
<tr>
<td>10% w/v sodium deoxycholate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka </td>
<td>30970-25G</td>
<td>Dissolved in water. Must be protected from light. Adjust pH to 7.0 with HCl, filter and store at room temperature.</td>
</tr>
<tr>
<td>250 mM phenazine methasulfate (PMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCI America</td>
<td>P0083</td>
<td>Dissolved in DMSO and aliquoted. Store at &#x2013;20 C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nitro-blue tetrazolium (NBT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco </td>
<td>0329-1G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3,3&#x2019;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>TCI America </td>
<td>D0078</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pb(NO3)2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>L62-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgSO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP213-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris base </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP152-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G45-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenosine 5&#x2019;-triphosphate disodium salt (ATP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>A2383-5G</td>
<td>Grade I, minimum 99%</td>
</tr>
<tr>
<td>beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) reduced form </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>N-8129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytochrome c From horse heart</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>C2506-250MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>BP220-212</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P8340</td>
<td>Store at &#x2013; 20 C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>D128-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue Stain 0.4%</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>15250-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10x Trypsin (0.5%)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>15400-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin Inhibitor </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco </td>
<td>17075-029</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

probing for mitochondrial complex activity in human embryonic stem cells

המיטוכונדריה הם אברונים cytoplasmic שיש להם תפקיד מרכזי במטבוליזם הומאוסטזיס הסלולר, הרגולציה של הרשת התא איתות, ועל מוות תאים מתוכנת. המיטוכונדריה לייצר ATP, להסדיר את המדינה חמזור cytoplasmic ו Ca2 + איזון, catabolize חומצות שומן, לסנתז heme, נוקלאוטידים, הורמונים סטרואידים, חומצות אמינו, לעזור להרכיב ברזל גופרית אשכולות בחלבונים. המיטוכונדריה יש גם תפקיד חיוני בייצור חום. מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי הגורם מספר סוגים של ההפרעה האנושית. הצטברות של מוטציות mtDNA בקורלציה עם הזדקנות חשוד יש תפקיד חשוב בהתפתחות סרטן. בשל תפקיד חשוב ביותר שלהם בכל סוגי תאים, הפונקציה של המיטוכונדריה חייב גם להיות קריטי עבור בתאי גזע. ההתקדמות מפתח נעשו הבנתנו הכדאיות גזע תאים, התפשטות, ויכולת הבחנה. אבל את הפעילות התפקודית של בתאי גזע, מעמד מסוים האנרגיה שלהם, עדיין לא נחקרו בפירוט. כמעט דבר אינו ידוע על המאפיינים של המיטוכונדריה בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) והצאצאים שלהם מבשר מובחן. אחת הדרכים להבין ולהעריך את התפקיד של המיטוכונדריה בתפקוד hESC ואת הפוטנציאל ההתפתחותי היא למדוד ישירות את הפעילות של מתחמי הנשימה במיטוכונדריה. כאן אנו מתארים ברזולוציה גבוהה ברור יליד ג&#39;ל אלקטרופורזה ובעקבות ב להדמיה ג&#39;ל הפעילות כשיטה לניתוח חמשת מתחמי שרשרת הנשימה של hESCs.

Watch this Scientific Journal Video about Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

בסרטון הזה, אנו יראה לכם כיצד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה קומפלקסים של בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות נותחו באמצעות מבחני פעילות ג&#39;ל.

גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

probing-for-mitochondrial-complex-activity-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  University of California, Los Angeles. בסרטון הזה, אנו יראה לכם כיצד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה קומפלקסים של בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות נותחו באמצעות מבחני פעילות ג'ל.

Video: Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

ב סימון במבחנה של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור דימות תהודה מגנטית

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

מורחים הכנה כרומוזומלית של בתאי גזע עובריים אנושיים עבור Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.