אנו מודים סיימון אלברטי לסיוע בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (GM25874), הווארד יוז רפואי Investigatorship המכון (ל SL), וכן הקרן הלאומית למדע מענק predoctoral הכשרה (עד ר&quot;ה).

<html> חלק 1: הכנת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מגש הליהוק ג&#39;ל. ציוד סטנדרטי עבור אלקטרופורזה DNA אופקי יכול לשמש. עבור מספר גדול של דגימות, אנו מכינים 20 ס&quot;מ X 24 ס&quot;מ לוח עם עד ארבעה 50-היטב מסרקים. ודא הלוח אין שריטות, כמו אלה יכולים לעוות את התמונה כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת פתרון 1.5% agarose (בינונית או גבוהה ג&#39;ל חוזק, EEO נמוך) ב 1X טה. הנפח צריך להיות מספיק כדי לצלול לחלוטין את השיניים מסרק - אתה רוצה לטעון מדגם ככל האפשר על מנת למקסם את הזיהוי. מיקרוגל התערובת עד agarose הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות SDS עד 0.1% מן המניות של 10%. מערבולת לערבב. אם agarose כמה מבצרת במהלך שלב זה, redissolve באמצעות צלחת חמה להיזהר רותחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון למגש הליהוק. שימוש במסרק לרוקן את כל הבועות, כפי שהם יכולים מאוחר יותר להפריע ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;ל קבע, להסיר מסרקים והמקום הג&#39;ל לתוך הטנק ג&#39;ל. לחלוטין את ג&#39;ל 1X טה לצלול המכיל 0.1% SDS. </li></ol> חלק 2: הכנת דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תפוקה גבוהה של lysates שמרים, אנחנו מתחילים עם 2-ml תרבויות גדל לילה טוב 96-חוסם עם תסיסה מהירה. במקרה זה, כל תרבות היא overexpressing חלבון של עניין. בניתוח חלבונים בשפע נמוך, תרבות כרכים גדולים יש להשתמש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב RCF 2000 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים מים צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בפתרון 1 מ&quot;ל spheroplasting. דגירה של כ -30 דקות ב -30 ° C (אתה יכול לאשר את היעילות spheroplasting ידי מיקרוסקופית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב RCF 800 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר לחלוטין supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts pelleted במאגר 100 מ&quot;ל תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הבלוק עם קלטת מערבולת על מהירות גבוהה במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה הסלולר פסולת בבית RCF 4000 דקות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות supernatant למיכל חדש, למשל, גם צלחת 96-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, תוכל לקבוע את הריכוז של חלבון lysates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ מדגם 4X את דגימות כדי ליצור lysates המכיל 1X חיץ המדגם. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען ג&#39;ל. אם תרצה, תוכל לחסוך חצי נפח מדגם להרתיח אותו לניתוח SDS-PAGE. על מנת לנטר את מידת העברת מאוחר יותר, כוללים מראש מוכתם SDS-PAGE הסמן. בנוסף, סמן משקל מולקולרי המורכב של חלבונים גדולים מאוד (למשל, עוף הפקטוראלי לחלץ) יכול לשמש כדי להעריך גודל של מתחמי נפתרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה במתח נמוך (3 ≤ V / ס&quot;מ אורך ג&#39;ל) עד ​​הכניסה לצבוע מגיע ~ 1 ס&quot;מ מהקצה של הג&#39;ל. זה ייקח כמה שעות. חשוב הג&#39;ל להישאר רגוע, אחרת דיפוזיה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך (לדוגמה, מונומרים) יכול להגביל את גילוי שלהם. </li></ol> חלק 3: העברת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פיסת nitrocellulose לממדי כמו הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 20 חתיכות של GB004 ו -8 פיסות נייר סופג GB002, לממדי כמו הג&#39;ל. חותכים חתיכה נוספת של GB004 לשמש הפתיל; לעשות את זה על 20 סנטימטרים יותר מאשר הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את nitrocellulose, פתילה, ו 4 חתיכות של GB002 ב 1X כפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיכל פלסטיק, להרכיב את ערימת ניירות כדלקמן: 20 חתיכות של GB004 יבש, אז 4 חתיכות של GB002 יבש, אז חתיכה אחת של GB002 מראש רטוב. הנח את nitrocellulose על גבי זה בערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הג&#39;ל על בקצרה את מגש הליהוק במים כדי להסיר את החיץ פועל עודף. ואז, בזהירות מתחילים להחליק את הג&#39;ל את המגש על הערימה. אמנם החלקת ג&#39;ל את המגש, לכבות את הממברנה עם כפות לפי הצורך. חיץ נוסף עוזר למנוע בועות מלהפוך לכודים תחת הג&#39;ל. פיפטה להעביר עובד היטב למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;ל הועברה מחסנית, לבדוק ביסודיות על בועות. אם יש כאלה, להרים את קצה הג&#39;ל ולהחיל מחדש חוצץ עד בועות יכול להיות עבד החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמים את יתרת three מראש הרטובות GB002 חתיכות על גבי הג&#39;ל. ודא קשר יסודי בין כל השכבות על ידי גלגול פיפטה בחוזקה לרוחב החלק העליון של המחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלע מחסנית העברה עם שני מגשים גבוהות המכיל כפות. לכסות את הפתיל מראש רטוב על פני מחסנית כזו או סוף הפתיל הוא שקוע כפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הערימה העברת התאספו עם מגש פלסטיק נוספת נושאת משקל נוסף (למשל, בקבוק 500 מ&quot;ל מים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להמשיך להעביר מינימום של שלוש שעות, או למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההעברה, הקרום יכול להיות מעובד על ידי תקן המערבי סופג. </li></ol> Spheroplasting פתרון 1.2 מ &#39;ד סורביטול 0.5 mM MgCl 2 20 מ&quot;מ טריס, pH 7.5 BME 50 מ&quot;מ (להוסיף טרי) 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Zymolyase 100T (להוסיף צח) coration: להדגיש: &quot;&gt; תמוגה הצפת 100 מ&quot;מ טריס 7.5 50 mM NaCl 10 mM BME (להוסיף צח) מעכבי פרוטאז (להוסיף צח) לדוגמא 4X הצפת טה 2X 20% גליצרול 8% SDS כחול bromophenol להעדפה

<ol>
	<li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+[PSI+]+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104.">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li><li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast:+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION.">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li><li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle:+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+[PSI+].">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li><li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+[RNQ+]+seeds+necessary+for+prion+propagation..">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation..</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis.">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase.">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li><li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+(eRF3)+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids.">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li><li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability.">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity.">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li><li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein(a)+phenotyping.">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li></ol>

SDD-AGE דווח לראשונה על ידי Kryndushkin et al. 1, ללמוד SDS עמידים קומפלקסים של [PSI +] הפריון של שמרים, ומצא כי השימוש הנרחב ללמוד הן הפריון ואת הפריון הלא אגרגטים 2-9. עם זאת, העברה של חלבונים כדי אלקטרופורזה קרום הבאים ג&#39;ל agarose הוא בעייתי, והוא יכול להביא תמונה כתם מעוות 5. בנוסף, טכניקה electroblotting שקוע הנפוץ ביותר מציג מגבלות מעשיות בגודל של הג&#39;ל ולכן מספר דגימות כי יכול להיות מעובד. אנחנו צריכים לטפל בבעיות אלה על ידי המעסיק להעביר נימי כלפי מטה 10, הליך פשוט אשר משתמשת ערמת ניירות סופג יבש להעברת חלבונים מן הג&#39;ל על קרום nitrocellulose. העברת נימי מונע עיוות ומאפשר ג&#39;לים גדול להיות מעובד בנקל. יש כמה דברים לשקול לפני השימוש SDD-AGE. לקבלת דוגמיות גולמי (למשל, lysates), immunodetection של חלבונים מסוימים הוא הכרחי. SDD-AGE אינו מלא לפגל קומפלקסים חלבונים של עניין, כל כך את החלבון (ים) כדי להתגלות חייב לשאת תג epitope מחוץ לאזור amyloidogenic. Lysates יכולים בדרך כלל להיות מוכנים כפי שהם היו להיות נורמלי SDS-PAGE, עם שני הבדלים חשובים. ראשית, הטיפול חייב להילקח מוגברת כדי למנוע השפלה ידי proteolysis. התנאים חלקית denaturing משמש כאן אינם מספיקים כדי להשבית פרוטאזות, והוא יכול גם לייצר חלבונים היעד רגישים יותר proteolysis. השתמש קוקטייל להשלים מעכבי פרוטאז בריכוז לפחות כפולה מומלץ. שנית, חימום הדגימות יש להימנע. אם פקד כל מונומר שלילי הרצויה, למשל כדי לאשר גבוהה מולקולרית משקל מינים שאינם בשל שינויים קוולנטיים, דגירה של 10 דקות בשעה 95 ° C יכול לשמש, אשר תשחזר ביותר amyloids לחלבון monomeric.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>zymolyase 100T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seikagaku America</td>
<td>120493-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>78429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybond-C extra nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>RPN303E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GB004 blotting paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>10427926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GB002 (3MM Chr) blotting paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>3030-917</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose (UltraPure)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

screening for amyloid aggregation by semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis

צבירה עמילואיד קשורה רבים misfolding פתולוגיות חלבון בבסיס המאפיינים זיהומיות של פריונים, שהם conformationally עצמית בניית תבנית חלבונים, כי הם חשבו שיש תפקידים מועילים אורגניזמים נמוכה יותר. Amyloids היה קשה ללמוד לשמצה בשל שבחוסר שלהם הטרוגניות מבנית. עם זאת, החלטה של ​​פולימרים עמילואיד על בסיס גודל שבחוסר אבקת כבר מתאפשרת על ידי חצי Denaturing דטרגנט-agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה (SDD-AGE). טכניקה זו היא למצוא שימוש נרחב לגילוי ואפיון של וריאנטים עמילואיד קונפורמציה. הנה, אנחנו מדגימים עיבוד של טכניקה זו המאפשרת את השימוש בו יישומים בקנה מידה גדול, כגון מסכי עבור פריונים הרומן amyloidogenic חלבונים אחרים. השיטה החדשה SDD-AGE משתמשת להעביר נימי של אמינות גדולה יותר וקלות השימוש, והוא מאפשר לכל ג&#39;ל בגודל להיות לאכלס. לכן, מספר גדול של דגימות, שהוכן תאים או חלבונים מטוהרים, יכול להיות מעובד בו זמנית עבור נוכחות של SDS מסיס conformers של החלבונים המתויגים.

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis at JoVE.com

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

screening-for-amyloid-aggregation-semi-denaturing-detergent-agarose

Research

JoVE Journal

Biology

26.7K Views.  Whitehead Institute for Biomedical Research. SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

Video: Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry and molecular biology researchers1-4. For laboratories that perform daily analyses of proteins, the cost of commercially available polyacrylamide gels (&tilde;$10/gel) can be considerable over time. To mitigate this cost, some researchers prepare their own polyacrylamide gels. Traditional methods of pouring these gels typically utilize specialized equipment and glass gel plates that can be expensive and preclude pouring many gels and storing them for future use. Furthermore, handling of glass plates during cleaning or gel pouring can result in accidental breakage creating a safety hazard, which may preclude their use in undergraduate laboratory classes. Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels simultaneously by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment. In addition, plastic gel cassettes are extremely resistant to breakage, which makes them ideal for undergraduate laboratory classrooms.

Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels at a time by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment.

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucin Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of pre-clinical agents labeled with fluorescent probes. With recent advancements in antibody based cytotoxic drug delivery systems, understanding the alterations induced by these agents within the realm of receptor aggregation and internalization is of critical importance. This protocol leverages the well-established methodology of fluorescent immunocytochemistry and the open source FIJI distribution of ImageJ, with its inbuilt autocorrelation and image mathematical functions, to perform spatial image correlation spectroscopy (ICS). This protocol quantitates the fluorescent intensity of labeled receptors as a function of the beam area of the confocal microscope. This provides a quantitative measure of the state of target molecule aggregation on the cell surface. This methodology is focused on the characterization of static cells with potential to expand into temporal investigations of receptor aggregation. This protocol presents an accessible methodology to provide quantification of clustering events occurring at the cell surface, utilizing well established techniques and non-specialized imaging apparatus.

Antibodies that bind to target receptors on the cell surface can confer conformation and clustering alterations. These dynamic changes have implications for characterizing drug development in target cells. This protocol utilizes confocal microscopy and image correlation spectroscopy through ImageJ/FIJI to quantify the extent of receptor clustering on the cell surface.

מיקרוסקופיה קונפוקלית מגלה התא קולטן משטח צבירת דרך התמונה המתאם ספקטרוסקופיה

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb the assembly and stability of OXPHOS complexes. This protocol describes the analysis of mitochondrial respiratory chain complexes by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) in application to cultured human cells. First, mitochondria are extracted from the cells using digitonin, then using lauryl maltoside, the intact OXPHOS complexes are isolated from the mitochondrial membranes. The OXPHOS complexes are then resolved by gradient gel electrophoresis in the presence of the negatively charged dye, Coomassie blue, which prevents protein aggregation and ensures electrophoretic mobility of protein complexes towards the cathode. Finally, the OXPHOS complexes are detected by standard immunoblotting. Thus, BN-PAGE is a convenient and inexpensive technique that can be used to evaluate the assembly of entire OXPHOS complexes, in contrast to the basic SDS-PAGE allowing the study of only individual OXPHOS complex subunits.

This protocol demonstrates the analysis of mitochondrial respiratory chain complexes by blue native polyacrylamide gel electrophoresis. Here the method applied to cultured human cells is described.

ניתוח של מתחמי שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי בתאים תרבותי אנושי באמצעות כחול מקורי לזיהוי בג'ל ו- Immunoblotting

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb ...