מולקולה אחת, שיפור פלואורסצנטיות הנגרמת על ידי חלבון יכול להחמיא מדידות FRET מולקולה אחת בעת לימוד תת-אוכלוסין מבני חלבון וקונפורמציות, במיוחד במקרים שבהם תת אוכלוסין מבניים ברורים מדווחים על מבנים מקומיים יציבים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא לוכדת תת-אוכלוסיות מבניות ייחודיות לאתר בהתבסס על סביבת אתר תיוג הצבע למשטחי החלבון. מולקולה אחת, חלבון המושרה שיפור פלואורסצנטיות יכול להיות מיושם על כל מערכת ביומולקולרית של עניין לחקור אוכלוסין ייחודי, מקומי, מבני.
התחל על ידי הכנת 25 פיקומולר סולפו-Cy3-תווית אלפא-סינוקלאין במאגר מדידה בצינור כריכה חלבון נמוך. הוסף 100 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר BSA לשקופית כיסוי מיקרוסקופיה של 18 תאים ודגרה למשך דקה אחת, ולאחר מכן, להשליך את BSA. הוסף 100 מיקרוליטרים של 25 דגימת אלפא-סינוקלאין עם תווית פיקומולר סולפו-סיי-סי-3 לתא של שקופית החלקת הכיסוי.
לאחר מכן, לרכישת הנתונים, הוסף טיפה של מים אולטרה-פצליים בחלק העליון של העדשה האובייקטיבית טבילת מים בצמצם גבוה, תקן את שקופית החלקת הכיסוי בתא הבמה ולאחר מכן התקן את ההרכבה בחלק העליון של שלב המיקרוסקופ. מביאים את העדשה האובייקטיבית כלפי מעלה עד שטיפת המים מעל העדשה האובייקטיבית תרוח בתחתית שקופית החלקת הכיסוי, ופתחו את תריס הלייזר. כאשר העדשה האובייקטיבית נעה כלפי מעלה, בדוק את התבנית של הטבעות האוורייריות במצלמת CCD.
הטבעת הראשונה מייצגת את המוקד בממשק המים/זכוכית, והטבעת השנייה מייצגת את המוקד בממשק שבין הזכוכית לפתרון לדוגמה. הגדל את גובה העדשה האובייקטיבית ב-75 מיקרומטר כדי להביא את מיקוד הלייזר עמוק בתמיסה למזעור האוטופלואורסצנטיות מפני השטח של הזכוכית של שובר הכיסוי. כוונן את כוח הלייזר בעדשה האובייקטיבית כ-100 מיקרו-וואט.
התחל ברכישת הפוטונים שזוהו לזמן מוגדר מראש. פתח את מחברות יופיטר ולאחר מכן פתח את המחברת לדוגמה. טען את קובץ הנתונים FRETBursts ו- Photon-HDF5.
השתמש בהיסטוגרמה של הזמנים הבין-פוטוניים כדי לחשב את שיעורי הרקע עבור כל 30 שניות של רכישת נתונים. הזז חלון זמן של פוטון אחד בכל פעם עבור 20 פוטונים רצופים, ואסוף את נתוני הפוטונים אם קצב הפוטון המיידי F גדול לפחות פי 11 מקצב הרקע לתקופה זו של רכישת הנתונים. חשב את גודל הפרץ ואת כמות הפוטונים בפרץ, את משך הפרץ, את הפרש הזמן בין זמני זיהוי הפוטוס האחרונים והראשון בפרץ, את בהירות הפרץ, את הערך הגדול ביותר של קצב הפוטוס המיידי בפרץ, ואת הפרדת הפרץ, מרווח הזמן בין התפרצויות רצופות.
התווה את ההיסטוגרמה של ערכי בהירות פרץ עם ציר האירועים בקנה מידה לוגריתמי. הגדר את סף הבהירות של הפרץ כערך הבהירות המינימלי של פרץ שממנו היסטוגרמה מציגה תבנית מתפוררת, ובוחרים את התפרצויות עם ערכי בהירות הגדולים מסף הבהירות המתפרץ. עבור פרץ ממוצע מדידת חיים פלואורסצנטית, התווה את ההיסטוגרמה של פוטון ננו-זמן עבור כל הפוטונים בפרצים שנבחרו עם ציר ספירת הפוטונים בקנה מידה לוגריתמי.
הגדר את סף הננו-זמן כערך הננו-זמן המינימלי שממנו היסטוגרמה של ננו-זמן פוטון מציגה תבנית מתפוררת. בחר רק את הפוטונים האלה עם ננו-זמן גדול יותר מסף הננו-זמן. חשב את הממוצע האלגברי של כל הננו-זמןים של הפוטן שנבחרו.
הפחת את סף הננו-זמן מהממוצע האלגברי של הננו-זמן בפוטון. הערך המתקבל הוא הננו-זמן הפוטן הממוצע של הפרץ, פרופורציונלי ישירות לתוחלת החיים הממוצעת של פלואורסצנטיות. שרטט את ההיסטוגרמה של כל אורך החיים של הפלואורסצנטיות.
תת-אוכלוסין מבוזר באופן מרכזי של חיי פלואורסצנטיות עשוי להופיע. תת-הת-אוכלוסין עם ממוצעים בעלי ערך נמוך יותר מייצגים את המינים המולקולריים עם סולפו-Cy3 שלא נחסמו באופן סטרי, בעוד שתת-אוכלוסין עם ממוצעים בעלי ערך גבוה יותר מייצגים את מיני המולקולות עם S-Cy3 שהיו חסומים יותר באופן סטרי. להערכת הדינמיקה האיטית שבין פרץ, התווה את ההיסטוגרמה של זמני ההפרדה המתפרצת עם ציר זמן הפרדה בקנה מידה לוגריתמי.
בחר כדי לשמור את כל הזוגות של התפרצויות רצופות המופרדים על-ידי פחות מזמן הפרדה מרבי המגדיר את תת-המולקולה. התווה היסטוגרמה או פיזור של אורך החיים הפלואורסצנטי הממוצע של ההתפרצויות הראשונה והשנייה עבור כל זוגות ההתפרצויות החוזרות מתחת לסף זמן הפרדה מסוים. היסטוגרמות של אורך החיים הממוצע פלואורסצנטי של מולקולה אלפא-סינוקלאין-56 אחת, המסומנת בתווית S-Cy3, הראתה כי תת-אכלוס הראשון היה בעל אורך חיים פלואורסצנטי אופייני של 1.6 ננו-שניות, ומייצג מצבים קונפורמציה אלפא-סינוקלאין עם מעט משטחי חלבון בקרבת שאריות 56.
תת-אכלוס השני היה בעל אורך חיים פלואורסצנטי אופייני של 3.5 ננו-שניות וייצוג מצבי קונפורמציה אלפא-סינוקלאין עם משטחי חלבון נוספים בקרבת שאריות 56. מקטעי רכיב הבטא שאינם עמילואיד של מולקולות אלפא-סינוקלאין ידועים באימוץ מבנה סלילי, סיכת ראש על כריכה בשלפוחיות SDS, אשר אושר כאוכלוסייה אחת לכל החיים פלורסנס עם חיים אופייניים של כשלושה ננו שנייה, והיעדר תת-אוכלוסייה עם משך החיים האופייני של 1.6 ננו שנייה. ההיסטוגרמה של זמני ההפרדה בין התפרצויות רצופות של מולקולה אחת מדווחת על מולקולות חוזרות על הפרידה פעמים מהירות יותר מ-100 אלפיות השנייה, שם התפרצויות ראשונות ושניות נובעות מאותה מולקולה.
היסטוגרמה הממוצעת של כל התפרצויות המולקולות הבודדות הראתה תת-אוכלוסין עם אורך חיים אופייני קצר, כמו גם עם חיים אופייניים ארוכים, מה שמצביע על כך שמולקולות בודדות יכולות לעבור מעברים בין ערכי חיים ממוצעים שונים איטיים יותר מאשר זמני משך פרץ. בתוך זמני הפרדה מתפרצים של 100 אלפיות השנייה לכל היותר, היה שבריר של מולקולות שהחלו כפרץ ראשון בתת-אכלוס תוחלת החיים הקצרה, וחזרו על עצמן כפרץ שני בתוך תת-אכלוס ארוך תוחלת החיים. בעוד שבריר המולקולות שהחלו כפרץ ראשון בתת-אוכלוסין ארוכת-טווח, וחזרו על עצמן כפרץ שני בתוך האוכלוסייה קצרת החיים, מצביע על המעברים בין שתי התת-אוכלוסיות בתוך 10 עד 100 אלפיות השנייה.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניתוח תוצאות הניסוי הוא להפריד כראוי אותות פלואורסצנטיות של מולקולה אחת מהרקע, ולנתח התפרצויות עם מספיק ננו-זמן פוטון. פיתוח smPIFE סלל את הדרך לחוקרים לחקור אינטראקציות חלבון חומצת גרעין ברמת המולקולה הבודדת. התקדמות זו מניחה את הקרקע לחקר הדינמיקה המבנית המקומית בתוך חלבונים.
