אנו מודים למר האג&#39;ימה Ichijo עצות עבור וידאו הקלטה מועיל עבור עריכת וידאו. כמו כן, אנו מודים Drs.Yuji Tsunekawa ו Kaichi Yoshizaki עבור עוזר סוג הקלטה וידאו. עבודה זו נתמכת על ידי KAKENHI על B המדען הצעיר על תחומי המדע, מולקולרית המוח עדיפות מ MEXT של יפן. אנו מכירים את התמיכה של גלובל COE תוכנית &quot;יסוד Translational המרכז לחקר מדעי המוח גלובל&quot; מ MEXT של יפן המחקר Core למדע וטכנולוגיה Evolutional ו (CREST) ​​מתוך מדעי החברה היפנית למדע וטכנולוגיה של היפנים הסוכנות וטכנולוגיה (JST) .

1. הגדרת מערכת WEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשותף קרום 0.22 מיקרומטר מסנן צינור סיליקון מפרצון בתוך מערכת WEC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את השסתום של גליל גז המכיל O 2 (95%) ו - CO 2 (5%). תזרים את תערובת גז לתוך התוף דרך בקבוק המכיל מים מבעבעים autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את עוצמת הזרימה של התערובת דלק 50 סמ&quot;ק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בואו צינור סיליקון לתוך בקבוק המים לבדוק את זרימת תערובת הגזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את התוף במהירות של 20 סל&quot;ד / min. </li></ol> 2. הכנת בינוני תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברוש להפשיר מיד, centrifuged (IC) בסרום על 37.0 מעלות צלזיוס ב). הוסף את D-גלוקוז (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לתוך בסרום מופשר בכוס 100 מ&quot;ל autoclaved. בינוני התרבות צריכים להיות מוכנים ברמה התרבות העיקרי (למשל, באמצעות מכסה המנוע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לאנטיביוטיקה antimycotic (100x) נוזל סרום עם 1: 400 דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאדות isoflurane הנותרים (עקב ההרדמה של חולדות במהלך איסוף דם) מן הנסיוב למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המדיום תרבות באמצעות 0.45 קרום מסנן מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 3.0 מ&quot;ל של המדיום בבקבוק כל תרבות לאטום את החלק העליון של כל בקבוק עם פקק סיליקון, מכוסה בנייר אלומיניום (ראה נ&quot;צ. 14) ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלוש או ארבע צלחות פטרי המכילות לרשות הדואר מלוחים של Tyrode). </li></ol> 3. הרדמה של החולדה ובידוד של הרחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברוש מתוזמן בהריון שאיפה עמוקה עם הרדמה או Parenteral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את אזור הבטן של חולדה בהריון הרדים עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את העור עם מלקחיים exteriorize את דופן הבטן על ידי חיתוך העור עם מספריים גדולות ו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את דופן הבטן עם זוג מלקחיים ולעשות בצורת U חתכים האורך גדול על דופן הבטן במספריים גדולים עד g רמת החזה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דובי משם את המעי לצד שמאל עם זוג מלקחיים ולחשוף קצה אחד של הרחם קשור השחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים את הקצה של הרחם עם זוג מלקחיים ולחתוך את המיקום בין הרחם לשחלות במספריים גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הרחם מן החולדה בהריון על ידי חיתוך שומן סביב הרחם עד לקצה השני של הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרחם כדי בצלחת פטרי המכילה תמיסת מלח של Tyrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש על ידי הממשל יתר של חומרי הרדמה או פריקה צוואר הרחם לאחר הסרת הרחם. </li></ol> 4. הסרת עוברים מן הרחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לשטוף את הרחם מלוחים של Tyrode ולהעביר אותו בצלחת פטרי השני עם צמד מצוין מלקחיים ח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ המשקפת, להרים את קיר הרחם עם זוג מלקחיים בסדר וחתך את קיר הרחם בבית מול צד mesometrium חיבור עם כלי דם באמצעות מספריים עיניים ישר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קצה מספריים עיניים ישר אל תוך החלל שבין קיר הרחם decidua. חותכים את דופן הרחם longitudinally בצד antimesometrial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סבך decidua בצד mesometrial ו conceptuses נפרד מן הרחם באמצעות שני זוגות מלקחיים בסדר i). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת conceptuses כדי בצלחת פטרי השלישי עם טפטפת זכוכית מעוקר עם קוטר מתאים. </li></ol> 5. Dissection של עוברי חולדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אחת קצה microforceps לתוך decidua ולעשות חתך רוחבי על decidua סביב conceptus עם שני זוגות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את קצות מלקחיים לתוך decidua בצד השליה לעשות שני חתכים על האורך decidua למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את decidua בצד השליה ידי קריעה על כך עם שני זוגות מלקחיים. הסר את decidua שנותרו עם שני זוגות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי הממברנה של רייכרט, לעשות חתך אופקי על זה, להפריד את הקרום מן conceptus בצד אנטי השליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושים חור קטן על שק החלמון ליד ראשו של העובר עם שני זוגות מלקחיים, וחתך את שק החלמון עם זוג מספריים עיניים מעוקל. חשוב לא לפגוע בכלי הדם הגדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את amnion באתר סביב ראשו של העובר עם שני זוגות מלקחיים בסדר, בעדינות לשלוף את העובר מתוך שק החלמון על ידי קריעת h amnion). גופתו של העובר צריך להיות שלף של שק החלמון כדי להגדיל את אספקת החמצן לעובר בשלב midgestation. </li></ol> 6. העובר שלמות תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק נזקים על השליה, שק החלמון, ואת מצבם של פעימות הלב ואת זרימת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיות מודע לא למתוח את חבל הטבור, העברתהעובר על בקבוק תרבות עם טפטפת זכוכית מעוקר. נשיאה של מעל מלוחים של Tyrode על בקבוקי תרבות צריך להיות כמה שפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת התוספת הלא חור סיליקון מהתוף rotator. חבר את בקבוק תרבות עם תקע עם חור אל התוף מסובב של מערכת WEC בניצב. היזהר שלא לשים בכוח על התוף לכיוונים מתאימים מאז תוף rotator הוא ציוד עדין מאוד. הבקבוקים המכילים את העובר גזור מועברים תרבות אחד אחד; פתיחת הדלת הקדמית של החממה צריך להיות ממוזער, כדי למנוע את הטמפרטורה בחממה יורדת י). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 שעות של תרבות, להגדיל את היקף הזרימה של התערובת דלק של עד 75 סמ&quot;ק עד 100 סמ&quot;ק לאחר 24 שעות (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדיום תרבות יש לשנות סביב 24 שעות על ידי העברת העובר תרבותי לתוך בקבוק תרבות חדשה עם המדיום מוכן טרי. להגדיל את נפח זרימת עד 125 סמ&quot;ק לאחר שעה 34 ועד 150 סמ&quot;ק לאחר 48 שעות (טבלה 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם לבדוק את מצבם של העוברים בתרבית על ידי ספירת קצב פעימות הלב (כלומר, 120-150/min הוא אופטימלי) ועל ידי התבוננות זרימת הדם. אם יש צורך לספור את מספר somites לשפוט את הצמיחה של עוברים מלוחים של Tyrode. בהתפתחות נורמלית, אחד somite הוא הוסיף תוך שעתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> WEC כאשר הוא סיים, להפסיק אספקת תערובת גז לנתק את צינור היניקה ואת קרום מסנן כדי למנוע חזרה לזרום לתוך צינור היניקה מהבקבוק מבעבע. </li></ol> 7. הערות <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמפרטורה בתוך המערכת WEC נשמר כל הזמן על 37.0-37.5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברוש 100% IC בסרום משמש באופן שגרתי WEC שלנו עוברים חולדה ועכבר, והמשיך ב -20 מעלות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו לרכוש עכברוש IC בסרום, אשר נאסף חולדות מורדמים עם isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקי פנויה זמינים גם מן Ikemoto ריקה. בקבוקים אטמי סיליקון יש autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection של עוברי צריך להתבצע בכל RT כי שמירה של עוברים בטמפרטורה נמוכה או גבוהה במהלך דיסקציה להשפיע על התפתחות שלאחר מכן ב WEC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים לניתוח הם מעוקרים ידי חום יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העור ואת דופן הבטן צריך לחתוך בנפרד, כדי למנוע זיהום של שערות לתוך צלחת האפשרי. אנו שינוי מספריים מלקחיים גדולים עם זוג חדש של אותם כאשר אנו לגזור את העור לבודד את הרחם, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים שקצותיהם בסדר חשוב מאוד לנתח רקמות בהחלט. אנו ידני לחדד את קצות מלקחיים עם אבן שמן מכונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים צד אחד של מלקחיים כמו סכין כדי למנוע לחץ עודף על עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הטמפרטורה בתוך המערכת WEC פוחתת ידי פתיחת הדלת שוב ושוב, אנו ממשיכים להדליק את האור כדי לשמור על הטמפרטורה בתוך המערכת. </li></ol> 8. נציג תוצאות איור 1 מציג נהלים של דיסקציה של העובר חולדה עוברי חולדה תרבותי. <img src="/files/ftp_upload/2170/2170fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תרבות העובר שלמים של העובר E12.5 את העכברוש. (א) conceptus גזור מן הרחם של חולדה בהריון. (ב) הסרת decidua בצד השליה. (ג) הסרת קרום של רייכרט. (ד) פתיחת שק החלמון. (ה) העובר עכברוש culturing בבקבוק במשך 6 שעות לאחר תחילת WEC. (ו) העובר עכברוש תרבותי עבור 42 שעות. ד, decidua; R; קרום של רייכרט, p, השליה, ys, שק חלמון, דואר, העובר. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> 0 hr </td><td> 12 שעות </td><td> 24 שעות </td><td> 36 שעות </td><td> 48 שעות </td></tr><tr><td> E12.5 עכברוש העובר </td><td> 95% 50 סמ&quot;ק </td><td> 95% 75 סמ&quot;ק (10 שעות) </td><td> 95% 100 סמ&quot;ק </td><td> 95% 125 סמ&quot;ק (34 שעות) </td><td> 95% 150 סמ&quot;ק </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מצב חמצן אופטימלית.

<ol>
	<li>New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intoroduction.+In+mammalian+postimplantation+embryos.">Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 1-14 (1990).</li><li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , 15-40 (1990).</li><li>Morris-Kay, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mammalian+embryos.">Postimplantation mammalian embryos.</a> Essential Developmental Biology A Practical Approach. , 55-66 (1993).</li><li>Fujinaga, M., Tuan, R. S., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+rodent+embryos+during+the+early+postimplantation+period.">In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period.</a> Developmental Biology Protocols. , 53-76 (2000).</li><li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis.">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).</li><li>New, D. A., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rotating+bottle+culture+method+with+continuous+replacement+of+the+gas+phase.">A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase.</a> Experientia. 35, 138-140 (1979).</li><li>Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+craniofacial+embryology+in+vitro.">Mammalian craniofacial embryology in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41, 187-194 (1997).</li><li>Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+of+the+mouse+prosencephalic+neural+plate.">Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate.</a> Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).</li><li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5.">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li><li>Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+labeling+of+mouse+rhombomeres+by+Cadherin-6::EGFP-BAC+transgenesis+underscores+the+role+of+cadherins+in+hindbrain+compartmentalization.">Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization.</a> Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).</li><li>Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inhibition+of+cyclin-dependent+kinases+that+lengthens,+but+does+not+arrest,+neuroepithelial+cell+cycle+induces+premature+neurogenesis.">An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis.</a> J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Arai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fabp7,+a+downstream+gene+of+Pax6,+in+the+maintenance+of+neuroepithelial+cells+during+early+embryonic+development+of+the+rat+cortex.">Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex.</a> J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ישנם שני שלבים קריטיים WEC מכרסם להצלחה. ראשית, הליך לנתיחה צריך להיות מדויק ולא עוברים נזק, בעיקר כלי הדם. שנית, ההליך צריך להיות מהר ככל האפשר כי החמצן מזין אינם מסופקים דרך השליה לאחר במנותק מן הרחם. זה קריטי עוברים יותר. במקרה של WEC עכברוש לאחר E12.5, אנחנו צריכים להעביר את העוברים גזור לתוך בקבוקים תרבות בתוך 30 דקות. ניתחנו דפוסי הנדידה של תאים עצביים לפסגה בסוג בר Pax6 עוברי עכברים מוטנטים על ידי תיוג מספר קטן של תאים עם פלורסנט לצבוע DiI או השתלת DiI שכותרתו תאים העוברים עכברוש סוג בר רקע מוטנטים 7. מפת גורל צלחת העצבית הקדמי כבר שלופה העכבר מהתווית תאים neuroepithelial עם DiI ו culturing במשך 24 שעות 8. WEC שימש גם לצורך השתלה של תאים לבטא את ה-GFP לתוך telencephalon של E12.5 עוברי חולדה לבחון אוטונומיה תא פגמים הגירה המוצג עכברוש Pax6 מוטציה 9. מעכבי שונים ניתן להחיל על המדיום תרבות לבחון במעברי האותות המעורבים היווצרות ציר מחזור התא במהלך 10 פיתוח, 11. יתר על כן, אנחנו יכולים פשוט להכניס פלסמידים ביטוי siRNA לתוך המוח המתפתח של עוברים בתרבית על ידי electroporation לנתח פונקציות גן 12,13,14. אנחנו גם חקר התנהגותם של תאים neuroepithelial שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי בתרבות איבר או תרבות פרוסה הבאה WEC (ראו נ&quot;צ. והפניות בו 14) 14. לכן, WEC מכרסם מאוד שימושי לא רק לניתוח השושלת התא, אלא גם עבור הגן על ידי הבהרת פונקציות הפסד פונקציה של ולהשיג-of-פונקציה ניסויים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td colspan="5"> הגדרת WEC </td></tr><tr><td> WEC המערכת (10-0310) </td><td> כלי </td><td> Ikemoto ריקה </td><td> 010-0310 </td><td> עוד דגם קטן הוא גם זמין. </td></tr><tr><td> הסיליקון תקע ללא חור </td><td> כלי </td><td> Ikemoto ריקה </td><td> 010-032-08 </td><td></td></tr><tr><td> תערובת גז גליל </td><td> כלי </td><td> ניקו Sanso </td><td> - </td><td> מכיל 95% חמצן, פחמן דו חמצני &amp; 5%. סדר מותאם אישית. </td></tr><tr><td> גז הרגולטור </td><td> כלי </td><td> אונו Seisakusho </td><td> WR-11 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 מיקרומטר לסנן Millex GS </td><td> כלי </td><td> Millipore </td><td> SLGS033SS </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> הרדמה ובידוד של הרחם </td></tr><tr><td> מספריים גדול </td><td> כלי </td><td> Napox </td><td> B-7H </td><td></td></tr><tr><td> מצבטים </td><td> כלי </td><td> Napox </td><td> A-3-2 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת פטרי סילוק (90 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ) </td><td> כלי </td><td> Iwaki </td><td> SH90-15 </td><td> עמוק סוג מאכל הוא הטוב ביותר לניתוח. </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> מגיב </td><td> אבוט </td><td> B506 </td><td> עבור הרדמה </td></tr><tr><td> Pentobarbital נתרן </td><td> מגיב </td><td> שרינג פלאו לבריאות בעלי חיים </td><td> - </td><td> עבור הרדמה </td></tr><tr><td> של מלח Tyrode </td><td> מגיב </td><td> - </td><td> - </td><td> לדברי כפרוטוקול ב Ref. 2. שמור על 4 ° C. </td></tr><tr><td> מתוזמן בהריון Sprague-Dawley עכברוש </td><td> בעל חיים </td><td> צ&#39;ארלס ריברס מעבדות יפן </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> הכנת בינוני תרבות </td></tr><tr><td> בקבוק זכוכית תרבות </td><td> כלי </td><td> Ikemoto ריקה </td><td> 010-032-05 </td><td></td></tr><tr><td> תרבות סילוק בקבוק </td><td> כלי </td><td> Ikemoto ריקה </td><td> 010-032-06 </td><td></td></tr><tr><td> הסיליקון תקע עם חור </td><td> כלי </td><td> Ikemoto ריקה </td><td> 010-032-07 </td><td></td></tr><tr><td> רדיד אלומיניום </td><td> כלי </td><td> כל חברה </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> מעוקר שקית </td><td> כלי </td><td> Hogy </td><td> HM-26 </td><td> עבור בקבוקי תרבות </td></tr><tr><td> מעוקר שקית </td><td> כלי </td><td> Hogy </td><td> HM-14 א </td><td> עבור אטמי סיליקון </td></tr><tr><td> 0.45 מיקרומטר לסנן Millex HA </td><td> כלי </td><td> Millipore </td><td> SLHA033SS </td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל צינור חרוטי </td><td> כלי </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 100 מ&quot;ל כוס </td><td> כלי </td><td> Iwaki </td><td> TE-32 </td><td></td></tr><tr><td> עכברוש IC בסרום </td><td> מגיב </td><td> צ&#39;ארלס ריברס מעבדות יפן </td><td> - </td><td> עיין: מר Kunihiko Morisaki, טל: +81- (0) 45-474-9336, פקס: +81- (0) 45-474-9340 </td></tr><tr><td> D (+), גלוקוז </td><td> מגיב </td><td> Wako </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> לאנטיביוטיקה antimyotic נוזלי </td><td> מגיב </td><td> Gibco </td><td> 15240 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5"> Dissection של עוברים </td></tr><tr><td> עיניים מספריים ישר </td><td> כלי </td><td> Napox </td><td> MB50-7 </td><td> עבור חיתוך דופן הרחם </td></tr><tr><td> עיניים מספריים מעוקל </td><td> כלי </td><td> Napox </td><td> MB54-2 </td><td> עבור חיתוך שק החלמון </td></tr><tr><td> מלקחיים # 5 </td&gt; <td> כלי </td><td> מרץ </td><td> T6715 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים # 5F </td><td> כלי </td><td> רגינה </td><td> T6819 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית פיפטה </td><td> כלי </td><td> - </td><td> - </td><td> בעבודת יד באמצעות פיפטה פסטר. </td></tr><tr><td> מעוקר שקית </td><td> כלי </td><td> Hogy </td><td> HM-4 </td><td> עבור pipettes זכוכית </td></tr><tr><td> המשקפת מיקרוסקופ </td><td> כלי </td><td> לייקה </td><td> Mz7s </td><td></td></tr><tr><td> אור </td><td> כלי </td><td> לייקה </td><td> CLS 150XD </td><td></td></tr><tr><td> שמן האבן </td><td> כלי </td><td> אושידה יוקו </td><td> 833-2000 </td><td> עבור השחזה של מלקחיים </td></tr><tr><td> מכונת שמן </td><td> כלי </td><td> אושידה יוקו </td><td> 835-0000 </td><td> עבור השחזה של מלקחיים </td></tr></tbody></table>

the method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system

העובר שלמים תרבות (WEC) הטכניקה פותחה בשנת 1950 על ידי בניו של וחבריו, והגיש בקשה בביולוגיה התפתחותית 1. למרות התפתחות וצמיחה של עוברי יונקים תלויים באופן קריטי על תפקוד השליה, WEC הטכניקה מאפשרת לנו עכבר התרבות עוברי חולדה מצב vivo לשעבר בתקופות מוגבל המתאים בשלבים עובריים midgestation במהלך היום (ה &#39;) 6.5-E12.5 ב עכבר או E8.5-E14.5 בחולדה 2, 3, 4. ב WEC, אנחנו יכולים ישירות ליעד המבוקש תחומי עוברים באמצעות קנס זכוכית הנימים כי עוברי ניתן להשפיע מתחת למיקרוסקופ. לכן, WEC מכרסם הוא טכניקה שימושית מאוד כאשר אנו רוצים ללמוד תהליכים התפתחותיים הדינמי של עוברי יונקים postimplanted. עד כה, מספר סוגים של מערכות WEC פותחו 1. בין אלה, את הכתף מסוג התרבות מערכת בקבוק הוא הפופולרי ביותר מתאים לתרבות לטווח ארוך של עוברים ב midgestation, כלומר, לאחר E9.5 ואת E11.5 של העכבר חולדה, בהתאמה 1. בפרוטוקול הווידאו הזאת, אנחנו מדגימים את הנהלים הרגילה שלנו של WEC עכברוש לאחר E12.5 באמצעות מודל מזוקק של מערכת המפרק המקורי, אשר תוכנן על ידי ניו Cockroft 5, 6, ו להציג יישומים שונים של טכניקת WEC ללימודי התפתחותי יונקים הביולוגיה.

Watch this Scientific Journal Video about The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System at JoVE.com

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

טכניקה שלמים תרבות העובר מאפשר לנו עכבר התרבות עוברי חולדה<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; מצב בתקופות מוגבל המתאים בשלבים midgestation. בפרוטוקול הווידאו הזאת, אנחנו מדגימים את הנהלים תקן של התרבות שלנו עובר שלם חולדה לאחר E12.5 באמצעות המפרק מסוג התרבות מערכת בקבוק.

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

the-method-rodent-whole-embryo-culture-using-rotator-type-bottle

Google

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Views.  Tohoku University Graduate School of Medicine. טכניקה שלמים תרבות העובר מאפשר לנו עכבר התרבות עוברי חולדה לשעבר vivo מצב בתקופות מוגבל המתאים בשלבים midgestation. בפרוטוקול הווידאו הזאת, אנחנו מדגימים את הנהלים תקן של התרבות שלנו עובר שלם חולדה לאחר E12.5 באמצעות המפרק מסוג התרבות מערכת בקבוק.

Video: The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of the lung endoderm with its surrounding mesenchyme and mesothelium. Lung mesenchyme has been shown to be the source of inductive signals for lung branching morphogenesis. Epithelial-mesenchymal-mesothelial interactions are also critical to embryonic lung morphogenesis. Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system (in the absence of maternal influence and blood flow). More importantly this technique can be readily done in a serumless, chemically defined culture media. Gain and loss of function can be achieved using expressed proteins, recombinant viral vectors and/or analysis of transgenic mouse strains, antisense RNA, as well as RNA interference gene knockdown.

Early embryonic lung organ culture is a very useful system to study epithelial-mesenchymal interactions. Both epithelial and mesenchymal morphogenesis proceeds under specific conditions that can be readily manipulated in this system.

עכבר עובריים תרבות ריאות, מערכת הערכת המנגנונים המולקולריים של מסעף

Lung primordial specification as well as branching morphogenesis, and the formation of various pulmonary cell lineages requires a specific interaction of ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Evaluating the Angiogenetic Properties of Ovarian Cancer Stem-Like Cells using the Three-Dimensional Co-Culture System, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular matrix. The ability of CSCs to participate in the development of endothelium constitutes an important characteristic that directly contributes to the general understanding of the mechanisms of tumorigenesis and tumor metastasis. The purpose of this work is to establish a reproducible methodology to investigate the tumor-initiation capability of ovarian cancer stem cells (OCSCs). Herein, we examined the neovascularization mechanism between endothelial cells and OCSCs along with the morphological changes of endothelial cells using the in vitro co-culture model NICO-1. This protocol allows visualization of the neovascularization step surrounding the OCSCs in a time course manner. The technique can provide insight regarding the angiogenetic properties of OCSCs in tumor metastasis.

Ovarian cancer stem cells (OCSC) are responsible for cancer initiation, recurrence, therapeutic resistance, and metastasis. The OCSC vascular niche is considered to promote self-renewal of OCSCs, leading to chemoresistance. This protocol provides the basis for establishing a reproducible OCSC vascular niche model in vitro.

הערכת התכונות האנגיוגנטיות של תאים דמויי גזע של סרטן השחלות באמצעות מערכת תרבית קו-תרבית תלת-ממדית, NICO-1

Cancer stem cells (CSCs) reside in a supportive niche, constituting a microenvironment comprised of adjacent stromal cells, vessels, and extracellular ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.