This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.

הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה נערכו על פי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לטיפול והטיפול האתיים בבעלי חיים, ועל-פי פרוטוקול שימוש בבעלי החיים אושר IACUC. תחזוקת קו 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי BAF3 תרבות במדיום RPMI-1640 בתוספת 10% בסרום שור עוברי ופניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / מיליליטר ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר) ובינוני תרבות בילה של תאי Wehi. לגדל תאי HEK293T בDMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי ופניצילין / סטרפטומיצין (100 יחידות / מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר). שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified המכילה 5% CO 2. </li></ol> 2. פלסמיד בנייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכפל את העכבר JAK2 ואיזופורם JAK2-V617F שבעור בpMSCV-פור-GW על ידי LR clonase באמצעות הליך שיבוט רקומבינציה סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבניית וקטור הביטוי בלוציפראז (pMSCV-לוק-הדובדבן-GW) המשמש ב- viההדמיה vo, להגביר לוציפראז מוקטור pLVX-ט-ON על ידי PCR באמצעות פריימרים (לוק-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG ולוק-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) ואחריו עם שיבוט בpENTR-SD-TOPO ליצור pENTR-לוק, המשמש להעביר את הגן בלוציפראז בוקטור retroviral, pMSCV-דובדבן-GW על ידי שיבוט תיווך רקומבינציה באמצעות clonase LR. </li></ol> 3. הכנת ספריית מוטציה אקראית, הקרנה וזיהוי המוטציות 3.1) אקראי mutagenesis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באורך מלא שיבוט של סוג בר JAK2 ומוטצית V617F לתוך וקטור retroviral pMSCV-הפור-GW באמצעות טכנולוגיית שיבוט רקומבינציה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד JAK2-V617F להפוך, XL-1 אדום, E. תאי coli, שהוא פגום במנגנוני תיקון DNA ובכך מאפשר להם לשלב מוטציות אקראיות בעת השכפול. באופן ספציפי יותר, לערבב 50-100 ng של DNA (DNA של יותר מ -100 ng מקטין את יעילות שינוי) עם 100 μl של תאים מוסמכים בצינור פוליפרופילן טרום צונן וטופחו על קרח למשך 30 דקות, בעדינות מתערבלת כל 5 דקות. לכיסוי ספרייה טוב, להשתמש 05:56 צינורות של תאים מוסמכים. הערה: DNA של יותר מ -100 ng מקטינה את יעילות שינוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הצינור באמבט מים ב 42 ° C להלם חום של 45 שניות ולדגור על קרח במשך 2 דקות. לאחר מכן, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום SOC (tryptone 2.0%, 0.5% תמצית שמרים, 0.05% NaCl, 10 מ&quot;מ MgCl2, 10 מ&quot;מ MgSO4, ושל 0.4% D-גלוקוז). דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בזמן רועד ב225-250 סל&quot;ד 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פלייט מצינור אחד בארבעה 10 סנטימטרים צלחות LB-אגר המכילים 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. דגירה הצלחות ל16-24 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מושבות גלויות, לאסוף אותם על ידי גירוד הצלחות עם מגרד צלחת סטרילית. תאי בריכה מכל DNA צלחת ופלסמיד המבודד באמצעות ערכת חילוץ פלסמיד מסחרית. הערה: בדרך כלל מושבות קטנות ולקחת 18-24 שעות כדי להיותגלוי כי אלה הם זני חיידקים הגדלים לאט. בשלב זה, להעריך את ההטרוגניות של מוטציות בספרייה על ידי עיכול הגבלה עם חותך תכוף כגון Sau3A1 או Taq1 או רצף. </li></ol> 3.2) ייצור Supernatants retroviral והתמרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני transfection, צלחת 4 x 10 6 תאי 293T HEK על 100 מנות סנטימטר בDMEM המכילות 10% FCS, פניצילין / סטרפטומיצין וL-גלוטמין 2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את המדיום וtransfect התאים עם ספריית pMSCV-JAK2-V617F mutagenized. לכל צלחת 10 סנטימטרים, לערבב 10 מיקרוגרם של ה- DNA (5 מיקרוגרם של ספריית פלסמיד ו5 מיקרוגרם של פלסמיד האריזה retroviral, pCLEco) עם 40 μl של FuGENE להיקף כולל של 400 μl באמצעות תקשורת DMEM חופשית בסרום. דגירה תמהיל DNA ושומנים בדם במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. לאחר 20 דקות להוסיף הטיפה המורכבת DNA שומנים בדם חכם על גבי תאי HEK293T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שש שעות, לשנות את תקשורת transfection wה- i תקשורת טרי ודגירת הצלחות במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס לייצור וירוס. לאחר 48 שעות של דגירה, לאסוף supernatants ויראלי המסונן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר acrodisc. </li></ol> 3.3) בחירה של שיבוטים עמידים במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למוטציות JAK2-V617F תרופה עמידות, transduce 100 מ&#39;BAF3 תא עם של supernatants וירוס שיש כייל נגיף של 0.5-1 x10 6 100 מיליליטר. באופן ספציפי יותר, לערבב 10 8 תאים עם של supernatant וירוס 100 מיליליטר להיקף כולל של 300 מיליליטר באמצעות תקשורת RPMI, סרום המכיל 10% ו -24 מיקרוגרם / מיליליטר של polyberene (ריכוז סופי של ployberene הוא 8 מיקרוגרם / מיליליטר). להפיץ מערבלי תאים אלה במספר רב של שש צלחות היטב (4-5 מיליליטר לכל טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצלחות ב 1,250 XG למשך 90 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בריכת התאים יחד ומערבבים עם Ruxolitinib ובינוני המכילים אגר רך ומצופה בsix צלחות גם. עבור כל ריכוז תרופה, לערבב 10 מיליליטר של תאי transduced BAF3 (10-20 מיליון תאים) עם הכמות המתאימה של Ruxolitinib בשפופרת 50 מיליליטר. מרכיבים את הנפח 40 מיליליטר באמצעות RPMI המכיל סרום 20%. הוסף 10 מיליליטר של אגר 1.2% לתאים, mixcarefully וצלחת בשש צלחות גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס במשך שבועיים. פיק המושבות עמידות באמצעות טיפים פיפטה 0.2 מ&quot;ל ותת-תרבותם בנפרד ב 24 צלחות גם במשך 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאי BAF3 העמידים על ידי צנטריפוגה ב 450 XG במשך חמש דקות בטמפרטורת חדר. לבודד את הדנ&quot;א הגנומי באמצעות ערכת בידוד הדנ&quot;א הגנומי מסחרית. PCR להגביר אורך מלא JAK2 cDNA משל פריימרים הגנומי DNA באמצעות (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG וmJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) וארוכת תבנית להרחיב מערכות PCR איכות גבוהה 100 ng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את מוצרי ה- PCR על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. בלו 3.4 kb של להקת DNA המייצג מסגרת קידוד JAK2 ולבודד את ה- DNAבאמצעות ערכת חילוץ ג&#39;ל מסחרית. רצף באורך המלא של cDNA באמצעות 8 פריימרים פנימיים (P1 - P8) פורש רצף הקידוד ורצפים לנתח באמצעות תוכנה מסחרית. </li></ol> 4. במבחנת אישור של מוטציות עמידות שיבוטים תא רבים לשאת מוטציה יותר מאחד, כדי לבדוק את תרומתו של כל מוטציה בפנוטיפ התנגדות, ליצור גרסאות שנבחרו על ידי מוטגנזה מכוונת באמצעות פלסמיד pMSCV-JAK2V-617F כתבנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע mutagenesis האתר מכוון על פלסמיד pMSCV-JAK2-V617F באמצעות ערכת mutagenesis מסחרית וoligonucleotides נועד ליצור מוטציות נקודה. לאשר את זהותם של שיבוטים מוטציה על ידי רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce תאי BAF3 עם רטרווירוסים נעשה באמצעות פלסמידים מוטציה אחריו עם בחירה באמצעות puromycin ב1μg / ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 10 4 תאי BAF3-JAK2-V617F (50 μl של RPMI עם 10% FCS) לבאר כל צלחת גם 96. נפרדly להוסיף 50 μl של תקשורת ruxolitinib המכיל את הבארות על פני הצלחת (הריכוז הסופי: 0, 1, 3, 5, 10, ו -20 מיקרומטר), ודגירת הצלחות במשך 60 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את כדאיויות תא על ידי הוספת 10 μl של מגיב WST-1 לכל ואחרי היטב עם דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות. שיא הספיגה ב A450 באמצעות קורא צלחת. לבצע את כל מבחני בשלושה עותקים ועלילה בממוצע ספיגה נגד INCB018424 ריכוזים. לבצע עקומת sigmoidal מיטבית באמצעות אלגוריתם הולם עקומה ליניארית. ציון ריכוז התרופה וכתוצאה מכך 50% כדאיות תא כIC50 הסלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, צלחת שישה מ&#39;BAF3 תאים לבטא גרסאות JAK2 בשש צלחות גם במדיום RPMI המכיל סרום 10% עם עלייה בריכוזים של ruxolitinib וטופחו במשך 4-6 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 450 XG במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS, וlyse ב -20 מ&quot;מ טריס-Cl (pH 7.5), 50mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 5 מ&quot;מ EDTA, 1 המ&quot;מ EGTA, 1 פלואוריד מ&quot;מ נתרן, 2 מ&quot;מ נתרן Vanadate, ו -5% גליצרול בתוספת מעכבי מעכבי פרוטאז קוקטייל וphosphatase. Sonicate ההשעיה תא 1 דקות ואחריו תוספת של חיץ טעינת ג&#39;ל 5x (350 מ&quot;מ טריס-HCl [pH 6.8], 500 מ&quot;מ DTT, 15% SDS, 10 מ&quot;מ Benzamidine, 5 מ&quot;מ EDTA, 5 מ&quot;מ EGTA, 5 מ&quot;מ נתרן Vanadate , קוקטייל פרוטאז, 50% גליצרול, ו0.001% bromophenol כחול) וdenaturation על 70 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתור את החלבונים על 8% ג&#39;ל polyacrylamide SDS בתנאי denaturing. בצע immunoblotting עם STAT5 אנטי-phopsho חד שבטי עכבר. להפשיט את הכתמים וreprobed עם נוגדן אנטי SATA5 polyclonal ארנב. דמיינו את הלהקות באמצעות ריאגנטים ECL בהתאם להמלצתו של הספק. </li></ol> 5. בVivo אישור ב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce תאי BAF3 להביע לוציפראז ודובדבן (transduced עם רטרווירוסים עשויים pMSCV-לוק-cherר&quot;י GW) עם וירוסים להביע JAK2-V617F וריאנטים עמידים. בחר תאים ששורדים בחירת puromycin לביטוי של JAK2 וריאנטים התנגדותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק שני מיליון תאים / דובדבן BAF3-לוק ומתרחבים ביצוע JAK2-V617F וריאנטים העמידים שלה ב -200 μl של PBS על 6 עכברי BALB / C באמצעות הזרקה לוריד זנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה ימים של השתלות תאים, להזריק עכברים עם Ruxolitinib (100 מ&quot;ג / קילוגרם) פעמיים ביום במשך שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הדמיה פליטת אור מבוסס לוציפראז עם מערכת הדמיה. . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקיצור, להכין פתרון luciferin ידי המסת 300 מ&quot;ג ל- 25 מיליליטר של מים סטריליים deionized, aliquot בנפח ובחנות קטנים יותר. הערה: luciferin החנות ב -80 ° C ולהגן מפני אור עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 250 μl לכל עכבר על ידי IP כדי להשיג 125 מ&quot;ג / קילוגרם בכל עכבר. להרדים את העכברים מאותה קבוצה יחד באמצעות isoflurane בשאיפה (1.5% -2.0%) בקופסא אטומה. החל משחה וטרינר על העין אלקטרוני למניעת יובש. הערה: הזמן שלוקח לעכברים לישון (10-15 דקות) אפשרה פעילות luciferin לשיא. שמור את הזמן עקבי בין הקבוצות, כדי למנוע וריאציה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העכברים מייד לבמת חדר הדמיה ולשמור על הרדמה בisofluorane 1.5-2% במהלך הליכי הדמיה. עכברי תמונה עם חשיפת שניות רציפה 0.1, 0.5, 1, 5, 30, 60, ו -300. צלם תמונות ולכמת עוצמת פליטת אור באמצעות רכישת תמונה ותוכנת ניתוח. בעקבות הדמיה להחזיר את העכברים חזרה לכלוב שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ל, הכולל תאים bonemarrow in vivo קציר chimerism. להרדים את העכברים עם CO 2 דקות 5 אחריו עם נקע בצוואר הרחם. לקצור את העצמות ולמחוץ ב 4 מיליליטר PBS הקר כדי לאסוף את מח העצם. נתח את התאים חיוביים דובדבן אחוזים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת באמצעות FACS. לאסוף עשרים אלף אירועים מכל מדגם. </li></ol>

<ol>
	<li>Huse, M., Kuriyan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+plasticity+of+protein+kinases.">The conformational plasticity of protein kinases.</a> Cell. 109, 275-282 (2002).</li><li>Melnikova, I., Golden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+protein+kinases.">Targeting protein kinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinases--the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century.">Protein kinases--the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).</li><li>Dancey, J., Sausville, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+and+progress+with+protein+kinase+inhibitors+for+cancer+treatment.">Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).</li><li>Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+inhibitors:+insights+into+drug+design+from+structure.">Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure.</a> Science. 303, 1800-1805 (2004).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome.">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).</li><li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells.">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nat Med. 2, 561-566 (1996).</li><li>Gorre, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+resistance+to+STI-571+cancer+therapy+caused+by+BCR-ABL+gene+mutation+or+amplification.">Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification.</a> Science. 293, 876-880 (2001).</li><li>Shah, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+BCR-ABL+kinase+domain+mutations+confer+polyclonal+resistance+to+the+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+(STI571)+in+chronic+phase+and+blast+crisis+chronic+myeloid+leukemia.">Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).</li><li>Branford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+of+point+mutations+clustered+within+the+adenosine+triphosphate-binding+region+of+BCR/ABL+in+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+or+Ph-positive+acute+lymphoblastic+leukemia+who+develop+imatinib+(STI571)+resistance.">High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance.</a> Blood. 99, 3472-3475 (2002).</li><li>Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoinhibition+and+STI-571/imatinib+resistance+revealed+by+mutagenesis+of+BCR-ABL.">Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL.</a> Cell. 112, 831-843 (2003).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dual+SRC-ABL+inhibitors+highlights+the+role+of+BCR/ABL+kinase+dynamics+in+drug+resistance.">Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).</li><li>Azam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AP24163+inhibits+the+gatekeeper+mutant+of+BCR-ABL+and+suppresses+in+vitro+resistance.">AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance.</a> Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).</li><li>Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+tyrosine+kinases+by+mutation+of+the+gatekeeper+threonine.">Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).</li><li>Soverini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+of+BCR-ABL1+kinase+domain-mediated+resistance+in+chronic+myeloid+leukemia.">Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia.</a> Leukemia research. 38, 10-20 (2014).</li><li>Deshpande, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+domain+mutations+confer+resistance+to+novel+inhibitors+targeting+JAK2V617F+in+myeloproliferative+neoplasms.">Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 26, 708-715 (2012).</li><li>Koppikar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimeric+JAK-STAT+activation+as+a+mechanism+of+persistence+to+JAK2+inhibitor+therapy.">Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy.</a> Nature. 489, 155-159 (2012).</li><li>Marit, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+mutagenesis+reveals+residues+of+JAK2+critical+in+evading+inhibition+by+a+tyrosine+kinase+inhibitor.">Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor.</a> PLoS One. 7, 43437 (2012).</li><li>Weigert, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+resistance+to+JAK2+enzymatic+inhibitors+is+overcome+by+HSP90+inhibition.">Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition.</a> The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).</li><li>Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+AC220+resistance+of+FLT3-ITD+by+SAR302503.">Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503.</a> Blood cancer journal. 3, 138 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

ההצלחה הקלינית של גליבק בטיפול CML הפגינה לא רק את הפוטנציאל של מיקוד קינאז האודם על ידי מעכבי מולקולה קטנים, אבל מגבלות גם חשפו טיפול ממוקד: חזרה קליני והופעה של מוטציות עמידות לתרופות בגן המטרה. זיהוי מוטציות התנגדות מסייע בניהול ופיתוח טובים יותר של מעכבי הדור הבא ק...

קינאז החלבון הם אנזימים רגולטוריים מרכזיים של מסלולי העברת אותות תוך-תאיים שלכאורה לווסת כל פונקציה סלולרית. בקרה נאותה של איתות kinase בתיווך היא קריטית להומאוסטזיס ופיתוח, אשר רובם מסתמך על רגולציה ראויה של קינאזות, phosphatases והשפלה שלה על ידי UPS (מערכת היוביקוויטין פרוטאזום). קינאז deregulated נמצא במרכז הבמה של סוגי סרטן רבים ומעורב בשורה של מחלות בבני אדם 1. הגנום אנושי מקודד יותר מ -500 קינאז חלבון שנקשר, במישרין או בעקיפין, ל~ 400 מחלות אנושיות 2. תצפיות אלה תמכו ברעיון למיקוד טיפולי של קינאז על ידי מעכבי מולקולה קטנים 3-5. ההפגנה של מעכבי קינאז ABL, כגון גליבק, בטיפול בלוקמיה מיאלואידית הכרונית (CML) סיפקה את ההוכחה של מושג לגישה זו 6,7. תצפית זו מהפכה בנמלים לא רקi-kinase טיפול אלא גם נאכף הרעיון לזהות נגעים הגנטיים במחלות אחרות גידולים למיקוד טיפולי, שתובלנה לגילוי של מוטציות סרטניות בJAK2 מפוליציטמיה (PV) וחולים עם שאתות myeloproliferative (MPN). תגלית זו עוררה עניין רב בטיפול בMPNs על ידי מיקוד JAK2 במעכבי קינאז מולקולה קטן. עכשיו, כמעט תריסר של מעכבי JAK2 נמצאים בניסויים קליניים ואחד מהם אושר לאחרונה לטיפול במיילופיברוזיס ראשוני. בעוד מיקוד ספציפי של קינאזות שעור על ידי מעכבי מולקולה קטנים בסרטן להביא תוצאות מבטיחות, היא גם סובלת ממפתחים עמידים לטיפול. למעשה, עד כה, חולים שטופלו במעכבים קינאז, כגון גליבק, ארסתי, Erlotinib וdasatinib פיתחו מוטציות התנגדות בעיקר על ידי רכישת מוטציות בתחום קינאז שתרופה מיועדת ל8-10. התנגדות כתוצאה ממוטציה בגן מדגישה את המגבלות of ממוקדת טיפול יחיד נגד קינאז שהעור, ומייצגת את האתגר הבא בהתפתחות של סרטן כימותרפיה יותר ויותר מוצלחת. השלכות מכניסטית ופונקציונליות של עמידות לתרופות צריכות לספק רציונל לבחירה ועיצוב של תרכובות משלימות לפיתוח תרופות. מוטציות שזוהו באמצעות מסכי במבחנה, הראו רמה גבוהה של מתאם עם אלה שנמצאו בחולים. לכן, הקרנה במבחנה למוטציות המעניקות סמים התנגדות לזוגות יעד תרופה ניתנו באסיסטים פיתוח קליניים או פרה-קליניים בזיהוי דפוסי ההתנגדות שעלול לגרום להישנות קלינית. זיהוי של מוטציות אלה הוא לא רק מועיל בניטור החולים לתגובת סמים ולהרע, אלא גם חיונית לעיצוב של מעכבי הדור הבא חזקים יותר. לדוגמא, פיתוח של מעכבי BCR / ABL הדור הבא, Nilotinib וPonatinib, התאפשרו בגלל MEC יותרהבנות hanistic צברו מmutagenesis, מבני, ומחקרים תפקודיים. מוקדם יותר, יש לנו דיווחו על התוצאות של המסך שלנו באמצעות mutagenesis של BCR / ABL האקראי כדי לחשוף את הספקטרום של מוטציות המקנות עמידות למעכבים כגון 11,12 גליבק, 12 PD166326, ו -13 AP24163. התוצאות לא רק זיהו את המוטציות המקנות הישנות התנגדות ומחלה קלינית, אלא גם סיפקו את הבנת מכניסטית של עמידות לתרופות ולעקרונות המסדירים את תפקוד kinase 11,14. כאן אנו מספקים פירוט מתודולוגיים נוסף, באמצעות Ruxolitinib וJAK2 כזוג יעד סמים, כדי לאפשר יישום רחב יותר של אסטרטגית הקרנה זו.

<table><tbody><tr><td>Cell and Tissue culture&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3 Cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cells</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>A gift from Ross Levine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biological</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1X</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (life technologies)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Protamine sulfate</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml stock in water</td></tr><tr><td>Trypan Blue solution (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424 (Ruxolitinib)</td><td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 micron disc filter</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 micron nylon cell strainer</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL-1 red &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells</td><td>Agilent Tech</td><td>200129</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml stock solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Terrific broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood&amp;amp; tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Expand long template PCR system</td><td>Roche</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Sv gel and PCR clean up system</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Pure Yield plasmid mini prep system</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 &amp;amp; OmniMAX 2 Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&amp;nbsp; LR Clonase Enzyme mix&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11791019</td><td></td></tr><tr><td>Mouse reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor pestle</td><td>Coor tek&amp;nbsp;</td><td>60316 and 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Swing bucket rotor centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 automated cell counter</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting</td></tr></tbody></table>

a method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors

הגילוי של BCR / ABL כאונקוגן נהג בלוקמיה מיאלואידית הכרונית (CML) הביא לפיתוח של גליבק, אשר, למעשה, הוכיח את הפוטנציאל של מיקוד kinase בסרטן על ידי יעילות טיפול בחולי CML. תצפית זו חוללה מהפכה בפיתוח תרופות למקד קינאז שהעור מעורב בגידולים ממאירים שונים אחרים, כגון, EGFR, B-RAF, KIT וPDGFRs. עם זאת, חסרון עיקרי אחד של טיפולים אנטי-kinase הוא ההופעה של מוטציות עמידות לתרופות טיוח היעד להפחיתה או איבדה את הזיקה לסמים. הבנת המנגנונים המועסקים על ידי גרסאות עמידות לא רק עוזרת בפיתוח מעכבי הדור הבאים, אלא גם נותנת תנופה לניהול קליני באמצעות רפואה אישית. דיווחנו אסטרטגית retroviral וקטור מבוססת הקרנה לזהות את הספקטרום של ההתנגדות המקנה מוטציות בBCR / ABL, אשר סייעה בפיתוח הדור הבא BCR / ABL מעכבים. באמצעות Ruxolitinib וJAK2 כזוג יעד סמים, כאן אנו מתארים בשיטות הקרנה חוץ גופית שמנצלות את תאי BAF3 העכבר מבטאים את ספריית המוטציה האקראית של קינאז JAK2.

הופעתה של מוטציות גנטיות מהווה אתגר גדול עבור הטיפול אנטי kinase הממוקד. מחקרי מוטאציות, מלבד מתן תובנות מכניסטית ופונקציונליות שהם סייעו בבחירה ועיצוב של פיתוח תרופות מהדור הבא, גם מאפשר ניהול קליני טוב יותר ועשויים בעתיד להיות מועיל יותר לטיפול מותאם אישית. בניסוי זה...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors at JoVE.com

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

הופעתה של התנגדות גנטית נגד טיפול במעכבי קינאז מציבה אתגר משמעותי לטיפול בסרטן יעיל. זיהוי ואפיון של מוטציות עמידות נגד סמים חדשים שפותח מסייע בניהול טוב יותר קליני ועיצוב תרופת הדור הבא. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו להקרנה ואימות של מוטציות עמידות במבחנה.

שיטה להקרנה ואישור של מוטציות עמידות נגד קינאז המעכבים

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

a-method-for-screening-validation-resistant-mutations-against-kinase

Research

JoVE Journal

Biology

14.8K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center.  הופעתה של התנגדות גנטית נגד טיפול במעכבי קינאז מציבה אתגר משמעותי לטיפול בסרטן יעיל. זיהוי ואפיון של מוטציות עמידות נגד סמים חדשים שפותח מסייע בניהול טוב יותר קליני ועיצוב תרופת הדור הבא. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו להקרנה ואימות של מוט?...

Video: A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Biochemistry

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates approaching 85% are common. Unfortunately, patients often become refractory to the treatment by altering their signal transduction pathways. An implementation of the expression profiling with microarrays can identify the overall mRNA-level changes, and proteomics can identify the overall changes in protein levels or can identify the proteins involved, but the activity of the signal transduction pathways can only be established by interrogating post-translational modifications of the proteins. As a result, the ability to identify whether a drug treatment is successful or whether resistance arose, or the ability to characterize any alterations in the signaling pathways, is an important clinical challenge. Here, we provide a detailed explanation of antibody arrays as a tool which can identify system-wide alterations in various post-translational modifications (e.g., phosphorylation). One of the advantages of using antibody arrays includes their accessibility (an array does not require either an expert in proteomics or costly equipment) and speed. The availability of arrays targeting a combination of post-translational modifications is the primary limitation. In addition, unbiased approaches (phosphoproteomics) may be more suitable for the novel discovery, whereas antibody arrays are ideal for the most widely characterized targets.

Here, we present a protocol for antibody arrays to identify alterations in signaling pathways in various cellular models. These changes, caused by drugs/hypoxia/ultra-violet light/radiation, or by overexpression/downregulation/knockouts, are important for various disease models and can indicate whether a therapy will be effective or can identify mechanisms of drugs resistance.

הערכה של התנגדות מעכבי טירוזין קינאז על ידי חקירה של האות התמרה חושית מסלולים על-ידי מערכים נוגדן

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Cancer Research

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental disorders. A characterization of disease-related RAF mutants will help us select appropriate therapeutic strategies for treating these diseases. Recent studies have shown that RAF family kinases have both catalytic and allosteric activities, which are tightly regulated by dimerization. Here, we constructed a set of practical and feasible methods to determine the catalytic and allosteric activities and the relative dimer affinity/stability of RAF family kinases and their mutants. Firstly, we amended the classical in vitro kinase assay by reducing the detergent concentration in buffers, utilizing a gentle quick wash procedure, and employing a glutathione S-transferase (GST) fusion to prevent RAF dimers from dissociating during purification. This enables us to measure the catalytic activity of constitutively active RAF mutants appropriately. Secondly, we developed a novel RAF co-activation assay to evaluate the allosteric activity of kinase-dead RAF mutants by using N-terminal truncated RAF proteins, eliminating the requirement of active Ras in current protocols and thereby achieving a higher sensitivity. Lastly, we generated a unique complementary split luciferase assay to quantitatively measure the relative dimer affinity/stability of various RAF mutants, which is more reliable and sensitive compared to the traditional co-immunoprecipitation assay. In summary, these methods have the following advantages: (1) user-friendly; (2) able to carry out effectively without advanced equipment; (3) cost-effective; (4) highly sensitive and reproducible.

In this article, we presented a set of practical and feasible methods for characterizing disease-related mutants of RAF family kinases, which include in vitro kinase assay, RAF co-activation assay, and complementary split luciferase assay.

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

הערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Medicine

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

הטמעה של<em&gt; במבחנה</em&gt; תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

זיהוי של מתווכים של קולטן תא T איתות באמצעות הקרנת הסרט מעכב כימי ספריות

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

שיטה להקרנה ואישור של מוטציות עמידות נגד קינאז המעכבים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video