11.18 : Cromatografia liquida ad alte prestazioni: processo di eluizione

Nella cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), il processo di eluizione è fondamentale per la separazione degli analiti e per la qualità dei risultati cromatografici. L'eluizione descrive come i composti si muovono attraverso la colonna e si separano in base alle loro interazioni con la fase mobile e con quella stazionaria. Questo processo determina la risoluzione, la forma del picco e i tempi di ritenzione nel cromatogramma, che sono essenziali per identificare e quantificare i componenti nelle miscele complesse. La comprensione del processo di eluizione aiuta a interpretare i dati cromatografici e a migliorare l'efficienza della separazione.

L'HPLC usa dei solventi di grado-HPLC altamente puri per garantire un'interferenza minima da impurità. I ​​solventi di grado elevato sono essenziali perché anche le tracce di contaminanti possono interferire con il processo di eluizione, distorcere i picchi del cromatogramma e ridurre la sensibilità durante il rilevamento del campione. Inoltre, i solventi possono contenere dei gas disciolti come l’azoto e l’ossigeno, che possono anche interferire con il rilevamento del campione. La degassazione viene impiegata per eliminare questi gas, usando una pompa a vuoto o spurgando con il gas elio, per mantenere l'integrità dei processi di separazione e il rilevamento.

I solventi degassati vengono quindi estratti dal serbatoio della fase mobile da una pompa ad alta pressione, con l’uso di una pompa alternativa che è il tipo più comunemente utilizzato. La pompa è composta da un pistone e due valvole di ritegno, che aspirano il solvente utilizzando il movimento avanti e indietro del pistone. Tuttavia, uno svantaggio della pompa alternativa è che produce un flusso di solvente pulsato. Pertanto, i moderni sistemi HPLC hanno uno smorzatore di impulsi collegato alla pompa per risolvere questo problema. Inoltre, sono disponibili altre pompe, come le pompe di spostamento a vite, ma possono avere delle limitazioni, come una minore capacità di solvente e una capacità di carico a bassa pressione, che le rendono meno convenienti per i cambi di solvente.

Esistono due tipi di processi di eluizione: l’eluizione isocratica e quella a gradiente. L'eluizione isocratica utilizza un singolo solvente, o fase mobile, durante la separazione, mentre l'eluizione a gradiente comporta una modifica della composizione durante il processo di separazione. Questo metodo migliora l'efficienza di separazione, riduce i tempi di analisi e aumenta la risoluzione, portando a dei picchi più nitidi nel cromatogramma. L'eluizione a gradiente fornisce una migliore risoluzione e produce dei picchi più distinti e separati, rendendo più facile l'interpretazione del cromatogramma per le miscele complesse rispetto all'eluizione isocratica.

Prima che la fase mobile entri nella colonna, il campione viene introdotto usando un iniettore a loop con una valvola a due posizioni. La valvola aiuta a dirigere la fase mobile verso la colonna. A causa dell'elevata pressione nell'HPLC, l'iniezione del campione non può essere eseguita come nella gascromatografia (GC). I loop di campionamento, con i volumi fissi che vanno da 0,5 microlitri a 2 millilitri, possono essere intercambiabili.