Stampa microcontatto di proteine ​​per Cell Biology

Riepilogo

Stampa microcontact viene utilizzato estensivamente alle proteine ​​modello e altre molecole sulle superfici dei materiali. Dimostriamo i passaggi fondamentali di questo processo, stampaggio modelli di fibronectina su vetro.

Abstract

La capacità di proteine ​​modello e altre biomolecole su substrati è importante per catturare la complessità spaziale dell'ambiente extracellulare. Sviluppo della stampa microcontatto dal gruppo Whitesides (

Protocollo

1. Preparazione delle soluzioni e dei materiali

Questi passaggi devono essere effettuati diversi giorni di anticipo.

1. Vetrini coprioggetto. Coprioggetto sono stati puliti per immersione per 10 minuti in una soluzione di detersivo Linbro 7X: acqua, mescolata ad un 1: 3 ratio e riscaldato, mescolando, fino a non toccare. Coprioggetto sono stati ampiamente sciacquati con acqua deionizzata, e poi cotto al forno a 450 ° C per 6 ore. Caricamento coprioggetto in rack colorazione ceramica (vedi reagenti) semplificato questo processo.
2. Soluzione proteica per stampaggio. Ricostituire fibronectina seguendo le istruzioni del produttore per una soluzione madre di 1 mg / ml di concentrazione.

2. Cast francobolli dal master topologico

Questi passaggi possono essere eseguiti diversi giorni di anticipo. Francobolli negozio modello-up in un piatto coperto, come un piatto di coltura di tessuti.

1. Rimuovere la polvere dal master utilizzando un flusso di compressa, aria filtrata o gas inerte.
2. Posizionare il, lato master fantasia alto, sul fondo di un piatto di plastica appena superiore a quella del maestro. 60 - o 100 mm piatti coltura tissutale sono adatte per questo scopo.
3. In un tubo di polistirene da 50 ml centrifuga, combinare i componenti Sylgard con un rapporto di catalizzatore: elastomero di base di 1: 10 in peso. Mescolare accuratamente con un dispositivo di plastica, come una pipetta monouso. Preparare almeno 0,2 ml di elastomero per centimetro quadrato di area piatto.
4. Centrifugare il tubo da 50 ml a 300 g per 5 minuti per rimuovere le bolle d'aria.
5. Versare l'elastomero sopra il maestro, poi posto in un essiccatore, sotto vuoto, per 30 minuti.
6. Curare l'elastomero in un forno a 65 ° C per almeno 2 ore. Polimerizzazione a temperature più elevate e più a lungo i risultati in tempi più rigido elastomero. Lasciate raffreddare a temperatura ambiente.
7. Separare il foglio di francobolli dal master.

3. Stampa microcontact della fibronectina su vetro

1. Tagliare un unico timbro. Francobolli di misura 4 mm x 4 mm a 1 cm x 1 cm in area e 1 - 2 mm di spessore sono più facili per iniziare. Luogo lato modello su un vetrino o un piatto di plastica di piccole dimensioni.
2. Posto timbro e un detersivo plasma, e di processo, sotto vuoto, per 30 secondi. Un Harrick scientifico plasma pulito (vedi attrezzature), impostare l'impostazione di massima di uscita renderà la superficie PDMS idrofila. Risultato più volte la rottura del elastomero.
3. Diluire la soluzione fibronectina con acqua deionizzata ad una concentrazione stampaggio di 50 mg / ml.
4. Mettere una piccola goccia (10 - 50 ml) di stampaggio soluzione sul timbro. Si diffonderà su tutta la superficie idrofila. Aggiungi unica soluzione sufficiente che la caduta di coprire il timbro, ma non travolto i bordi. Lasciate assorbire le proteine ​​di bollo per 5 minuti.
5. Utilizzando un Kimwipe ® o su altri tessuti carta pulita, stoppino via la maggior parte della soluzione proteica dal timbro, senza toccare la regione fantasia.
6. Asciugare la soluzione rimanente dal timbro sotto un flusso di aria pulita, asciutta, gas inerte, come l'azoto.
7. Utilizzando le pinzette, rimuovere il timbro dal vetrino, invertire, e mettere in contatto con il coprioggetto di vetro pulito (la superficie da fantasia). Mettere un peso sopra per promuovere un buon contatto. Il peso specifico che offre la migliore patterning dipende dalla dimensione del timbro e modello; iniziare con un peso di 5 g, e regolare tra stampati. Lascia timbro in contatto con la superficie per 1 minuto.
8. Con attenzione smontare la pila, e il timbro separato da coprioggetto.
9. Vigorosamente sciacquare il coprioggetto fantasia in PBS, seguita da acqua deionizzata, per rimuovere le proteine ​​che non è assorbito in superficie. Coprioggetto secco sotto corrente di azoto.

Rappresentante Risultati

Stampa microcontact è un potente processo di patterning molecole su superfici. Questo processo ha la capacità di creare funzioni con dimensioni che vanno da decine di micrometri a centinaia di nanometri, in fig. 1A, il logo a sinistra sono ogni 200 micron di altezza, mentre le macchie verdi illustrato nella fig. 1B sono 1 micron di diametro e distanziati ad intervalli di 4 micron, misurato da centro a centro. Fig. 1B illustra anche una proprietà potente di stampa microcontact, cioè che è e di processo additivo. Vari cicli di stampa microcontact può essere applicato a una singola superficie per creare sistemi multicomponente ^3.

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Discussione

Il processo di stampa microcontact è concettualmente semplice e molto robusto, essendo stata applicata a patterning una vasta gamma di molecole su una varietà di substrati. Tuttavia, questo processo rimane qualcosa di un'arte. La geometria specifica del modello da creare, le proteine ​​per essere modellata, peso applicato, e di rivestimento / condizioni di stampaggio tutti influiscono sulla qualità di stampaggio. Per esempio, troppo poco peso, applicata a funzioni di grandi dimensioni, si traduce spesso in lacune nel modello di c...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasma Cleaner		Harrick Scientific Products, Inc.	PDC-32G
Desiccator		Nalge Nunc international	5315-0150
PBS	Reagent	Invitrogen	10010-072
Protein labeling kit	Reagent	Invitrogen	A30006
Fibronectin	Reagent	Sigma-Aldrich	F2006
Staining rack	Reagent	Thomas Scientific	8542E40
Coverslips	Reagent	Fisher Scientific	12-544-12
Sylgard 184	Reagent	Ellsworth Adhesives	184 Sil Elast Kit
Diffraction Grating	Reagent	Edmund Scientific	3040267