Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

Riepilogo

Questo video mostra come morfolino o mRNA possono essere iniettati in embrioni di pesce zebra alla unicellulare stadio per diminuire o aumentare il livello di prodotti specifico gene durante lo sviluppo successivo.

Abstract

Uno dei vantaggi di zebrafish studio è la facilità e la velocità di manipolare i livelli di proteina nell'embrione. Morpholinos, che sono oligonucleotidi sintetici con la complementarità antisenso di RNA bersaglio, può essere aggiunto l'embrione di ridurre l'espressione di un prodotto particolare gene. Al contrario, mRNA elaborati possono essere aggiunti per l'embrione per aumentare i livelli di un prodotto genico. Il veicolo per l'aggiunta di mRNA o morfolino di un embrione è microiniezione. Microiniezione è efficiente e rapida, che consente per l'iniezione di centinaia di embrioni per ora. Questo video mostra tutte le fasi del processo di microiniezione. In breve, le uova vengono raccolte subito dopo la posa e allineati contro un vetrino da microscopio in una capsula di Petri. Poi, un bel punta l'ago caricato con materiale di iniezione è collegato ad un microinjector e una fonte d'aria, ed i controlli microinjector sono regolati per produrre un volume di iniezione desiderabile. Infine, l'ago è immerso nel tuorlo dell'embrione e la morfolino o mRNA viene espulso.

Protocollo

Parte 1: Produzione di uova e raccolta

1. La notte prima dell'iniezione, istituito il pesce in vasche di allevamento con divisori in posizione. Per aumentare la produzione totale di uova, il pesce può essere impostato in un rapporto di due femmine per un maschio se lo si desidera.
2. La mattina seguente, dopo le luci della stanza si accende, tirare i divisori da più serbatoi e lasciare per circa 20 minuti di tempo di accoppiamento indisturbato.
3. Utilizzando un colino, raccogliere le uova dalle gabbie di allevamento e risciacquare con acqua uovo. Versare le uova in una capsula di Petri con acqua uovo e rimuovere le uova non fecondate e detriti con una pipetta di trasferimento. I pesci possono essere raggruppati in grandi vasche per la produzione di turni aggiuntivi di uova per l'iniezione. Regolare i tempi di raccolta delle uova per consentire un numero massimo di uova da produrre senza farli passare alla fase singola cella.
4. Posizionare un vetrino da microscopio invertito nel coperchio di un piatto 100 millimetri Petri. Utilizzare una pipetta di trasferimento per allineare le uova contro il lato del vetrino che formano una singola colonna. Eliminare l'acqua in eccesso uovo dalla diapositiva premendo un Kimwipe contro il lato opposto le uova. (Figura 1A)

Parte 2: Ago tirare, il caricamento e la preparazione

1. Con un estrattore micropipetta, tirare un bicchiere 1,0 millimetri OD capillare in due aghi e conservare in un piatto da 150 millimetri di Petri che oltre rampe Silly Putty. Aghi può essere tirato in anticipo.
2. Ritardare l'ago con 3 ml di materiale di iniezione con una pipetta microloader. Agitare il bolo verso la punta dell'ago finché non ci sono bolle pochi o nessun rimanenti.
3. Accendere la fonte di aria e microinjector. Inserire l'ago nel microinjector e assicurare una perfetta tenuta all'interno della custodia. Controllare che il micromanipolatore si trova in una posizione adeguata per consentire una vasta gamma di movimento e di regolazione. Portare la punta dell'ago nel piano di vista del microscopio, alta dal palco, e mettere a fuoco la regione più sottile della punta. Usare un paio di pinze taglienti per pizzicare fuori l'ago in un punto che lascia l'ago sottile abbastanza per bucare il corion e il tuorlo, ma ancora in grado di fornire una dimensione coerente tallone. Una goccia di olio minerale su un micrometro può essere usata per calcolare il volume di ogni iniezione. Quando iniettato nel petrolio, una perlina con un diametro di 0,1 mm contiene 500 pL di materiale di iniezione (figura 1B); volumi di iniezione di 500 PL o 1nL sono tipicamente utilizzati. Premere il pedale e monitorare le dimensioni del cordone, mentre taglio l'ago e la regolazione della pressione di iniezione in base alle esigenze. Volumi di iniezione ideale riempirà circa il 10% del volume dell'uovo. La qualità della punta dell'ago è cruciale sia per la facilità di iniezione e la qualità e la coerenza dei risultati.

Parte 3: Iniezione

1. Assicurarsi che gli embrioni non hanno sviluppato oltre la fase quattro celle. Idealmente, gli embrioni dovrebbero essere al unicellulare stadio.
2. Abbassare l'ago verso la colonna di uova, tenendo il piatto in posizione con la mano opposta.
3. Perforare la superficie del corion e inserire il tuorlo in un colpo solo liscio durante la visione di qualsiasi schiacciamento o lacerazione del sacco vitellino. Iniettare il materiale iniezione nel tuorlo (figura 1C). Evitare di iniettare bolle d'aria o si estende il tuorlo sia come può essere letale per l'embrione. Di lavoro lungo la linea, regolare la pressione necessaria per mantenere una dimensione coerente tallone e, utilizzando un puntale, togliere le uova non fecondate che si affacciano o sono stati distrutti durante il processo di iniezione.
4. Dopo aver completato una colonna di uova, usare un getto di acqua dolce uovo di spostare le uova iniettato in una scatola di Petri pulita. Ripetere se necessario. Tenere diversi embrioni uninjected come controllo. Alla fine del primo giorno, rimuovere gli embrioni morti e registrare il numero di embrioni iniettati. Sostituire l'acqua uovo nel piatto periodicamente per ridurre la probabilità di infezione.

Parte 4: I risultati rappresentativi

A seconda di cosa viene iniettato, gli embrioni possono sopravvivere a un tasso inferiore rispetto ai loro fratelli uninjected. Fortunatamente, è facile per iniettare un gran numero di loro, quindi questo è raramente un problema. È normale che morphants di esporre sviluppo leggermente ritardata.

Per illustrare i risultati della microiniezione, abbiamo usato questo protocollo per manipolare i livelli della proteina Cuore di vetro (Heg). HEG è una proteina transmembrana necessario per lo sviluppo cuore normale. In sua assenza, gli embrioni sviluppano cuori con tratti afflusso gigantesco e camere ^1. Abbiamo iniettato due Morpholinos non descritte in precedenza contro HEG, heg_e3i3_egfr1 e heg_e4i4_egfr2, ad una concentrazione di 500 micron. A 2 giorni dopo la fecondazione, i controlli fratello uninjected appaiono normali, come previsto (figura 2A e B). Embrioni iniettati con heg_e3i3_egfr1 hanno edema cerebrale (figura 2C). Anche se i cuori della maggior parte di questi morphants hanno modificato la morfologia, le loro camere sono normalmente di dimensioni (figura 2D). Gli embrioni iniettatiheg_e4i4_egfr2 con difetti cardiaci mostra variabile. Alcuni appaiono normali, mentre altri hanno tratti afflusso di grandi dimensioni e atri moderatamente allargata (2E figura e F). Il mutante HEG, come riportato in precedenza ^1, ha un tratto d'afflusso enormemente ampliato e atrio (figura 2G e H).

Abbiamo anche iniettato embrioni tipo selvatico con 400 mRNA ng / mL trascritto da full-length HEG cDNA. Mentre i controlli uninjected svilupparsi normalmente (figura 3A e B), gli embrioni iniettati con mRNA HEG mostra uno spettro di fenotipi che vanno dalla comparsa di tipo selvatico ciclopia grave, accorciamento dell'asse corpo principale, necrosi della testa e del corpo, e difetti della linea mediana (figura 3C e D).

Embrioni Figura 1. Da iniettare sono allineati contro un vetrino da microscopio in una capsula di Petri (A). Volume di iniezione è determinata iniettando in olio minerale collocato su un micrometro. Un volume di iniezione di 500 PL, che è comunemente usato, ha un diametro di 0,1 mm (B). Immediatamente dopo l'iniezione, il morfolino o mRNA è visibile come una macchia punteggiano nel tuorlo (C).

Figura 2. A 2 giorni dopo la fecondazione, gli embrioni uninjected non hanno difetti lordo (A) o fenotipo cuore (B). Embrioni iniettati con il heg_e3i3_egfr1 morfolino hanno edema cerebrale (C, freccia) ma camere cardiache di solito di dimensioni (D). Alcuni embrioni iniettati con il heg_e4i4_egfr2 morfolino hanno tratti afflusso ampliato e atri (E, F). mutanti HEG sono tratti afflusso gravemente ampliato e atri (G, H). (A), (C), (E), e (G) sono 4x immagini DIC, (B), (D), (F) e (H) sono 20x immagini DIC. un atrio = it = tratto d'afflusso.

Figura 3. A distanza di 24 ore dopo la fecondazione, uninjected embrioni hanno un corpo lungo e dritto, senza difetti o necrosi della linea mediana (A) e due occhi ben definita con un tubo neurale tra di loro (B). Alcuni embrioni iniettati con mRNA HEG, al contrario, mostrano un asse del corpo ridotto, necrosi, somiti deformi (C), e ciclopia (D). (A) e (C) sono 4x immagini DIC, (B) e (D) sono 20x immagini DIC.

Discussione

Uno dei punti di forza del sistema modello Danio rerio è la facilità con cui i prodotti gene specifico può essere aggiunto o eliminato dal embrione di microiniezione. Per ubiquitariamente iperespressione di una proteina particolare, la codifica mRNA che viene iniettato nel tuorlo alla 1-cella di scena. Durante il successivo sviluppo dell'embrione, l'RNA è distribuito in tutto l'organismo e tradotto. Viceversa, per eliminare una particolare proteina, Morpholinos vengono utilizzati. Morpholinos sono oligonucleotidi sintetici progettati con la complementarietà di RNA antisenso specifici. Come mRNA, Morpholinos vengono iniettati nel tuorlo alla 1-cella di scena. All'interno l'embrione si legano il loro RNA bersaglio, evitando di traduzione.

La modifica principale che deve essere effettuata per ogni morfolino o mRNA è la concentrazione del materiale iniettato. Troppo alta la concentrazione di uno o morfolino mRNA possono causare tossicità non specifici, mentre ogni morfolino devono essere testati empiricamente per determinare la concentrazione ottimale, generalmente le concentrazioni di morfolino tra i 200 micron e 500 micron abbattere l'attività dei geni in modo efficace, senza causare non specifici difetti. La dimensione esatta dell'apertura ago non è cruciale. All'interno di una gamma di dimensioni dell'ago, la pressione d'iniezione e il tempo di iniezione possono essere regolati per produrre un bolo del volume corretta.

Morpholinos hanno molte applicazioni, tra cui la dissezione funzionale di domini all'interno di una proteina. Quando progettati per target specifici giunzioni esone-introne, Morpholinos impedirà il verificarsi di splicing lì. Abbiamo esaminato gli effetti di due Morpholinos che legano esone-introne giunzioni nel pre-mRNA di HEG. Il heg_e3i3_egfr1 morfolino lega la giunzione tra esone 3 e introne 3, impedendo il meccanismo di splicing nell'esone 3 che incorpora in trascrizioni maturi. Il heg_e4i4_egfr2 morfolino rimuove in modo simile esone 4. Sia esoni 3 e 4 codificano domini contenenti EGF-come ripete. Alcuni embrioni iniettati con heg_e4i4_egfr2 moderatamente fenocopia il mutante; ulteriori esperimenti saranno tenuti a comprendere il ruolo del Heg esone 4 in sviluppo cuore. Sorprendentemente, gli embrioni iniettati con heg_e3i3_egfr1 hanno edema cerebrale, una caratteristica che non si vedono in mutanti HEG. Ciò può essere dovuto alla capacità di Morpholinos di legare trascrizioni materno che lascia impregiudicata in mutanti zigotico.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI 100
Micromanipulator	Tool	Narishige International	MN 153
Needle Puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P 97
Glass Capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100 F6
Microloader Pipettes	Tool	Eppendorf	5242956.003
Needle Holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH310