Raccolta e Crioconservazione degli ovociti e di embrioni di topo criceto

Riepilogo

In questo video-articolo vi presentiamo un passo-passo dimostrazione su come raccogliere e crioconservare gli ovociti di criceto con elevate post-disgelo tassi di sopravvivenza. La stessa procedura può anche essere applicato con successo per congelare e scongelare embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo preimpianto.

Abstract

Embrioni e ovociti crioconservati con successo sono stati più di 30 anni fa, quando Whittingham

Protocollo

La cura degli animali e le procedure sono state condotte secondo le linee guida e regolamenti approvati dal Comitato Etico per animali e la ricerca umana della Universitat Autònoma di Barcellona, ​​in Spagna.

I. ovociti collezione

1. Controllare e selezionare criceti femmina (Mesocricetus auratus; 8-12 settimana di età) del ceppo d'oro siriano per la presenza di uno scarico di spessore vaginale (scarica fase postovulatoria).
2. Indurre femmine selezionati per superovulate mediante iniezione intraperitoneale di 40 UI di PMSG (Pregnant Mare Serum gonadotropina), seguita da 40 UI di hCG (gonadotropina corionica umana) 60 ore dopo.
3. Euthanize criceti femmina 16 ore dopo la somministrazione di hCG in una camera di anidride carbonica.
4. Isolare ovidotti dalle femmine, come mostrato nel video e trasferirli su una goccia di KSOM-H media.
5. Raccogliere ovocita-cumulo complessi strappando l'ampolla ovidotto sotto un microscopio stereoscopico in una goccia di ialuronidasi (156 U / ml) a 37 ° C. Ovociti sarà liberato da cellule del cumulo in circa 5 minuti.
6. Pick up ovociti da ialuronidasi e lavarli due volte in KSOM-H media.

Per la raccolta di embrioni di topo, topi di sesso femminile (Mus musculus, 6-8 settimane di età) sono indotti a superovulate mediante iniezione intraperitoneale di 5 UI di PMSG seguito da 5 UI di hCG dopo 48 ore e accoppiati con topi di sesso maschile. Le femmine sono sacrificati per dislocazione cervicale a 24-26, 44-46 o 54-56 ore dopo la somministrazione di hCG per ottenimento dei pronuclei, 2-4-cell o cellule di embrioni fase, rispettivamente. Raccolta di embrioni pronuclei viene eseguita esattamente come descritto per ovociti di criceto. Embrioni nelle fasi di 2-celle e 4-celle vengono raccolti svuotando la ovidotti con KSOM-H media [6].
Nota: A seguito di questo protocollo circa 20 o 30 ovociti / embrioni possono essere raccolti da ogni femmina.

II. Preparazione di gelo e disgelo soluzioni

1. Preparare la soluzione mi diluendo 0,57 ml di propilenglycol in 5 ml di KSOM-H (1,5 M di propilenglycol).
2. Preparare la soluzione disgelo con l'aggiunta di 2 ml di KSOM-H ad un tubo con 0,2052 g di saccarosio (0,3 M di saccarosio).
3. Preparare la soluzione di congelamento con l'aggiunta di 2 ml di soluzione che ho ad un tubo con 0,0684 g di saccarosio (1,5 M di saccarosio propilenglycol e 0,1 M).

Nota: I Solution e il congelamento e scongelamento soluzioni devono essere preparate poco prima del loro utilizzo. Tuttavia, la determinata quantità di saccarosio da utilizzare per la preparazione delle soluzioni di congelamento e scongelamento può essere ponderata in anticipo e conservati in 3 ml tubi a temperatura ambiente per diversi mesi.

III. Protocollo di congelamento

1. Ovociti trasferimento / embrioni dal KSOM-H medio-una goccia di soluzione di I e incubare per 7-15 minuti a temperatura ambiente.
2. Nel frattempo, preparare un piatto di 90 millimetri di Petri per caricare il cannucce mettendo 90 gocce ml di congelamento e scongelamento soluzioni come viene mostrato nel video (1 goccia di ogni soluzione / paglia).
3. Trasferire il numero desiderato di ovociti / embrioni per le gocce soluzione di congelamento.
   Nota: Di solito trasferimento tra 5-30 ovociti o embrioni / drop.
4. Allegare una cannuccia in un sistema controllato aspirazione bocca e caricarlo seguendo questo ordine: soluzione che, d'aria, con la caduta di congelamento degli ovociti, aria, calo di scongelamento, aria.
5. Una volta la paglia viene caricato, mantenere l'aspirazione fino a quando la prima goccia introdotto (soluzione che ho) raggiunge il polimero alla fine superiore della paglia e tenute questo fine. Thermo-seal l'altra estremità della paglia o di tenuta con un tappo in plastica.
6. Accendere il congelatore programmabile e selezionare il programma di congelamento. Il programma di congelamento utilizzato in questo protocollo si basa sulla velocità di raffreddamento originariamente pubblicato da Lassalle et al. [7]:
   • 2 ° C / min dalla temperatura ambiente a -7 ° C
     0 ° C / min per 10 minuti per consentire l'equilibrio di temperatura e di induzione di semina (vedi sotto)
   • 0,3 ° C / min da -7 ° C a -30 ° C
     0 ° C / min per 2 minuti per consentire l'equilibrio di temperatura
   • 35 ° C / min da -30 ° C a -130 ° C
7. Caricare le cannucce sugli slot del titolare del congelatore programmabile, assicurandosi che la parte della paglia con la goccia di soluzione di scongelamento è rivolto verso l'esterno. Avviare il programma di congelamento.
8. Quando la temperatura del campione raggiunge i -7 ° C ed il raffreddamento è in attesa, effettuare la semina manuale: tuffo la pinza in azoto liquido, tirare i titolari un po 'fuori dal freezer per esporre la parte del cannucce contenente le gocce di soluzione di scongelamento, e subito tocco questa parte del cannucce con le pinze. Ripetere per ogni titolare e ogni paglia nel supporto, e poi lasciare che il programma di congelamento fino alla fine.
9. Quando il programma è completato, i titolari tuffo in azoto liquido.
10. Rimuovere le cannucce daltitolari e loro trasferimento in un alberello con etichetta.
11. Infine, memorizzare i alberello all'interno di un serbatoio di azoto liquido.

IV. Scongelamento protocollo

1. Rimuovere la cannuccia dal serbatoio di azoto liquido.
2. Mantenere la paglia a temperatura ambiente per 40 secondi.
3. Mettere a bagno la paglia in un bagno d'acqua a 30 ° C durante 40 secondi.
4. Togliere la spina dalla paglia o tagliare il termosaldata punta.
5. Svuotare la paglia in un 35-mm piastra di Petri e mescolare delicatamente le due gocce contenenti le soluzioni di congelamento e scongelamento.
6. Lascia ovociti / embrioni nella miscela per 15 minuti a temperatura ambiente.
7. Trasferimento ovociti / embrioni di un calo fresco di KSOM-H per altri 15 minuti a 37 ° C.
8. Ovociti / embrioni sono ora pronti per ulteriori manipolazioni.

Nota: Durante i passi 6 e 7 si dovrebbe vedere che gli ovociti scongelati / embrioni lentamente si gonfiano a causa di reidratazione.

V. Rappresentante Risultati

L'utilizzo del protocollo di crioconservazione qui riportati si traduce in un tasso di sopravvivenza di circa il 95% per ovociti di criceto e del> 90%, 85% e 80% per il mouse B6CBAF1 embrioni al pronucleo, 2-cell stadi e 4-celle, rispettivamente. Quando sono embrioni di topo coltivati ​​in vitro in KSOM dopo lo scongelamento, almeno 70 al 80% dovrebbe arrivare allo stadio di blastocisti in condizioni di coltura ottimali.

Si raccomanda di includere un gruppo di controllo (paglia) di ovociti / embrioni in ogni esperimento di congelamento e di scongelamento questo gruppo prima del resto degli ovociti / embrioni vengono utilizzati per ulteriori manipolazioni. Se i tassi di sopravvivenza per il gruppo di controllo sono inferiori alle attese, disgelo un'altra paglia dello stesso lotto. Se i tassi di sopravvivenza per questo secondo gruppo sono bassi, scartare il restante cannucce da questo lotto di congelamento.

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Discussione

Con questo protocollo e ovociti di criceto embrioni di topo possono essere crioconservati con successo. Una volta congelati, gli ovociti / embrioni possono essere conservati in serbatoi di azoto liquido a tempo indeterminato e recuperato in qualsiasi momento o luogo desiderato. Questo offre il vantaggio di avere campioni quasi pronto per l'uso in caso di necessità. D'altra parte, questo protocollo può essere utilizzato anche per generare criobanche embrione di ceppi di topi di valore (come linee transgeniche), come alternativa eco...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
French type mini-straw 0.25 ml		Mini-tub	13407/0010
hCG		Farma-Lepori, Spain	749036.4
Hyaluronidase		Sigma	H-3884
KSOM-H medium				Ref. [11]
Liquid Nitrogen		Air Liquide
Plastic plugs		Mini-tub	19046
PMSG		Intervet, Spain	1.614/8447
Propilenglycol		Fluka	82280
Sucrose		Merck	107687
Surgical Scissors		Aesculap	BC-060R; BG-061R
Thermo-sealer		SIZ	220
35 and 90 mm culture dishes		Nunc	153066; 150350
10 ml tubes		Greiner Bio-one	163160
Nitrogen tank		MVE, Cryogenics	XC 43/28
Programmable Freezer		Planner Products Ltd.	Kryo-10 Series III
Forceps		Aesculap	BD-331R; BD-053R; OC-020R