Raccolta e Preparazione Drosophila Gli embrioni per la registrazione elettrofisiologici e altre procedure

Riepilogo

Questa tecnica espone il neuromusculature Drosophila embrionali per immunoistochimica o registrazione elettrofisiologica. E 'utile per studiare eventi precoci nello sviluppo neuromuscolare o l'esecuzione di elettrofisiologia in mutanti che non possono schiudersi.

Abstract

Drosophila è un modello premier genetico per lo studio sia dello sviluppo embrionale e funzionale delle neuroscienze. Tradizionalmente, questi campi sono abbastanza isolati gli uni dagli altri, con storie in gran parte indipendenti e le comunità scientifiche. Tuttavia, l'interfaccia tra questi campi di solito disparati sono i programmi di sviluppo funzionali alla base dell'acquisizione di proprietà elettriche di segnalazione e la differenziazione delle sinapsi chimici funzionali durante le fasi finali della formazione circuito neurale. Questa interfaccia è un'area estremamente importante per le indagini. In Drosophila, queste fasi di sviluppo funzionale si verificano durante un periodo di <8 ore (a 25 ° C) durante l'ultimo terzo di embriogenesi. Questo periodo tardo di sviluppo è stato a lungo considerato intrattabile a causa indagine per la deposizione di un duro, cuticola impermeabile epidermica. Un passo avanti è stato anticipato l'applicazione di acqua-polimerizzazione colla chirurgica che può essere applicata a livello locale per la cuticola per permettere la dissezione controllato di fase avanzata di embrioni. Con una incisione longitudinale dorsale, l'embrione può essere posato piatto, esponendo il cordone ventrale dei nervi e muscolatura della parete del corpo di indagine sperimentale. Questo sistema è stato molto utilizzato per isolare e caratterizzare mutanti genetici che impedire la formazione embrionale sinapsi, e quindi svelare i meccanismi molecolari che regolano la specificazione e differenziazione delle connessioni di sinapsi e funzionali, le proprietà di segnalazione sinaptica.

Protocollo

Parte 1: Attrezzature e Forniture

1. Un microscopio a dissezione buona è necessaria per dissezioni embrione; ingrandimento 40X è suggerito, con 25X oculari per aumentare al massimo ingrandimento.
2. Una pinza sottile (numero 5) sono necessari per la selezione manuale di embrioni e devitellinization degli embrioni.
3. Attrezzature per creare e modificare gli aghi buon bicchiere è richiesto. Tirato in vetro aghi sono necessari per la dissezione. Noi preferiamo vetro solido per la dissezione (durano più a lungo), ma di serie pareti spesse tubo di vetro (diametro esterno 1-1,5 mm) funziona pure. Alcune persone usano aghi tungsteno fine, elettrolizzata per la nitidezza desiderata in un bagno di NaOH 1M con un + 10 Amp batteria autotrasformatore. Aghi affilati dissezione tungsteno hanno il vantaggio di essere relativamente resistenti e di lunga durata. Aghi di vetro cavo (formato simile a elettrodi di patch clamp) sono collegati a tubi di plastica e utilizzato durante la dissezione per l'aspirazione ed espulsione di soluzione salina, così come la consegna controllata di colla. Una varietà di estrattori di vetro sono disponibili per la produzione di aghi di vetro. Computer programmato estrattori può essere regolato per tirare una varietà di forme e dimensioni. Il Brown-Flaming modelli (Sutter Instrument Co.) sono ampiamente favorite. Un microscopio composto (20-40X obiettivo) dovrebbero essere disponibili per controllare e modificare gli elettrodi prima dell'uso.
4. Due tipi di soluzioni sono comunemente usati per il bagno durante la dissezione dei tessuti embrionali: 1) "standard" (Jan e Jan, 1976a) o "standard modificato" (Broadie, 2000) saline, basato su soluzioni comunemente usati per la registrazione in altri sistemi di invertebrati , e 2) "emolinfa-like" (HL) saline (Stewart et al 1994), un compromesso tra la soluzione salina standard e le concentrazioni ioniche misurate nella emolinfa Drosophila. Va notato che nessuna di queste saline imitano con precisione la composizione chimica di emolinfa in vivo (Broadie, 2000). Standard di soluzione salina contiene (in mm): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl _2, 1.8 CaCl _2, 72 saccarosio, 5 TES, pH 7,2. Sperimentatori possono anche prendere in considerazione salina insetti preparati commercialmente (ad esempio Schneider Media insetti), che non è adatto per la registrazione elettrofisiologica ma molto probabilmente per proteggere la salute dei tessuti esposti.

Parte 2: Staging Embryo e dissezione

1. Per la raccolta delle uova ottimale, mantenere giovani (<7 giorni), maschio sano e mosche di sesso femminile (20-40) su cibi freschi vasi che per 2-3 giorni. Pentole posa comunemente costituiti da 100 bicchieri di plastica ml (Tri-Versare) perforata per fornire un'adeguata circolazione dell'aria, che copre una piastra di agar 60 mm. Piastre di agar contenenti mele o succo d'uva indurito con agar. Esistono diverse ricette, ma un esempio è la seguente: 700 ml di acqua, 25-30 grammi di agar, 300 ml di succo concentrato (uva o di mela), 0,5 g metilparaben (p-hydroxymethylbenzoate) e 30g di zucchero. Autoclave l'acqua e agar e far bollire a parte il p-hydroxymethylbenzoate con lo zucchero e il succo. Mescolare l'agar e soluzioni succo di frutta e versare rapidamente in 60 piastre mm, rimuove le bolle.
2. Prima della raccolta delle uova, le mosche sono alimentati con pasta di lievito (7 grammi di lievito di birra in 9 ml di acqua conservato a 4 ° C) su piatti freschi, cambiata almeno due volte al giorno per almeno due giorni. Di giorno 3, un piatto buono dovrebbe produrre 100-200 uova all'ora. Deposizione delle uova migliore si osserva in una pentola mantenuto su un lato con l'agar nella piastra graffiato. Molti embrioni saranno stabilite nel o accanto ai graffi.
3. Per raccogliere un gran numero di embrioni, delicatamente trasferire gli embrioni dalla piastra di agar in un cesto con un pennello. Un cesto può essere fatto con un tubo da 15 o 50 ml per centrifuga. Tagliare la parte inferiore lasciando spazio sufficiente superficie per intrappolare uno schermo (70 mesh micron) tra il coperchio e la parte superiore del tubo. Sciacquare gli embrioni con dH ₂ 0 e messo in una piastra di Petri di fresco 50% al 100% di candeggina per rimuovere il corion esterno. In alternativa, le uova possono essere raccolti individualmente utilizzando una pinza sottile, e dechorionated mettendoli manualmente in una goccia di candeggina. De-chorionation può richiedere da 30 secondi a 2 minuti (candeggina fresca è molto più veloce), e devono essere monitorati sotto il microscopio di dissezione. La rimozione del corion espone la lucida, trasparente membrana vitellina. Dechorionated uova devono essere brevemente sciacquati, o posto in soluzione fisiologica, come candeggina distrugge rapidamente i tessuti devitellinized.
4. E 'fondamentale mettere in scena con attenzione embrioni per l'età evolutiva desiderato. La Drosophila definito stadio embrionale (1-17; Campos-Ortega e Hartenstein, 1985) non sono utili, come tutto lo sviluppo funzionale neuromuscolare avviene in fase avanzata o 16 stadio 17. Così, gli embrioni sono messo in scena da ora dello sviluppo a 25 ° C in un incubatore umidificato, in ore dopo la fecondazione o, più comunemente, dopo la deposizione delle uova (AEL). In queste condizioni, l'embriogenesi dura 21 + / - 1 ora a 25 ° C.
5. Uova da un tempo di uovo laici (1-2 hrs) che sono opportunamente invecchiato sono visti per la prossima criteri morfologici. Dopo il lavaggio in ampia dH ₂ O, le uova dechorionated sono posti in un piatto di plastica cultura (sotto dH ₂ O) per la visualizzazione. Corretta stadiazione può essere confermata con criteri morfologici usando la luce riflessa con un microscopio a dissezione (Campos-Ortega e Hartenstein, 1985). Maturo fase avanzata embrioni (22-24h AEL) sul punto di cova sono generalmente riconosciuti dalla segmentazione della cuticola e trachea gonfiati. Gli embrioni possono anche essere sottoposti a tipizzazione mediante GFP e bilanciatori di dissezione di un microscopio a fluorescenza con filtri appropriati.
6. Per la dissezione, embrioni dechorionated ed evolutivamente messo in scena sono fissati (lato dorsale verso l'alto) su un vetrino con una goccia di soluzione salina (vedi punto 1.5). Gli embrioni vengono rimosse dalla membrana vitellina da pungere la membrana verso la fine anteriore o posteriore, con una micropipetta di vetro o un ago di tungsteno, e poi delicatamente liberando l'embrione dalla membrana. In preparazione per la dissezione, l'embrione deve essere posizionato sul vetrino con la superficie dorsale up (lato dorsale fino dissezione esporrà il sistema nervoso ventrale e neuromusculature per gli esperimenti. Tuttavia, l'embrione può ovviamente essere posizionati in altri modi per facilitare l'accesso ad altri tessuti.)
7. Embrioni stadio precoce (<16 ore AEL) attaccano direttamente alla pulizia vetro o vetro rivestiti con polilisina (poli-L-lisina bromidrato; Broadie e Bate, 1993a, b). Vecchi embrioni (> 16 ore AEL), a seguito di formazione cuticola, deve essere incollato, idealmente Sylgard rivestite (Dow Corning) coprioggetto. Un'acqua-polimerizzazione colla cianoacrilato chirurgico o veterinario viene utilizzata (Broadie e Bate, 1993c, d). La colla è espresso attraverso una pipetta piccolo elettrodo di vetro (10-20 micrometri punta diametro interno) collegato ad un tubo di gomma con la colla flusso controllato dalla pressione bocca. Si deve prestare attenzione durante il parto colla, come la colla polimerizza rapidamente dopo il contatto con soluzione salina. Si noti inoltre che l'incollaggio non può essere eseguita in soluzione salina con nessuna o scarsa concentrazione di ioni bivalenti, come il collante necessario per polimerizzare gli ioni bivalenti. Piccole quantità di colla prima utilizzazione per fissare saldamente la testa e la coda.
8. Una volta che le estremità dell'embrione sono incollati al vetrino, un'incisione è fatta lungo la linea mediana dorsale con un elettrodo di vetro o un ago di tungsteno affilata. Ciò è reso più facile da dolci perforando la linea di incisione prima di effettuare il taglio finale. I lati dell'incisione vengono poi attaccato al vetrino con più colla, per diffondere delicatamente il piatto embrione. Gli organi interni tra cui l'intestino, i corpi grassi e, facoltativamente, trachea vengono eliminati tramite aspirazione con una pipetta di vetro collegato al tubo di gomma (Broadie e Bate 1993a-c). L'embrione dovrebbe essere allegato al piano coprioggetti, epidermide giù con la ventrale sistema nervoso centrale, nervi periferici, e somatiche muscolatura esposta per la sperimentazione.

Discussione

Precisa stadiazione di embrioni è critica a causa della rapida maturazione delle proprietà funzionali nel corso del tempo solo diverse ore. Diversi problemi complicare questa messa in scena. In primo luogo, molti ricercatori utilizzano uovo tempo stabilisce per gli embrioni palco, ma il tempo di deposizione delle uova può variare enormemente da animale ad animale in condizioni diverse (Broadie et al. 1992). In particolare, le femmine con una dieta limitata tendono a conservare le uova fecondate per periodi prolungati...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Embryo Collection Cages	Genesee Scientific	59-100 (for 60 mm dish; other sizes available)	Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video
Sylgard 184	Dow Corning	Available from various companies	Surgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips
Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mm	Various		For pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery
Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue application	Tygon		Tubing inner diameter needs to match glass outer diameter.