Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

Riepilogo

In questo video vi presentiamo il Ex vivo Generazione ed espansione dei diritti umani CD40 delle cellule B attivate (CD40-B) dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) attraverso la stimolazione con il ligando CD40 e l'interleuchina-4.

Abstract

CD40-attivate le cellule B (linfociti B CD40-) sono stati identificati come fonte alternativa di immuno-stimolatorie cellule presentanti l'antigene (APC) per l'immunoterapia del cancro ^1-3. Rispetto alle cellule dendritiche (DC), il miglior APC caratterizzato, le cellule CD40-B hanno diverse proprietà distinte biologici e tecnici. Simile alla DC, le cellule B mostrano un aumento dell'espressione di MHC e molecole co-stimolatorie (Fig.1b), mostrano una forte capacità migratoria e presentazione dell'antigene presente in modo efficiente alle cellule T, dopo stimolazione con il ligando dell'interleuchina-4 e CD40 (CD40L). Tuttavia, a differenza di DC immature o mature, le cellule B CD40-esprimono la piena triade nodo homing linfa composto da CD62L, CCR7/CXCR4, e la funzione dei leucociti antigene-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessaria per homing di organi linfatici secondari (Fig.1a) ^3. Cellule CD40-B può essere generato senza difficoltà da piccolissime quantità di sangue periferico che può essere ulteriormente espanse in vitro di grandi quantità di altamente puri-CD40 delle cellule B (> 10 ⁹ cellule per paziente) da donatori sani e come il cancro pazienti (Fig.1c, d) ^1,4.

In questo protocollo dimostriamo come ottenere pienamente attivato le cellule B CD40-da PBMC umane. Molecole chiave per la coltura cellulare sono ligando CD40, l'interleuchina-4 (IL-4) e ciclosporina A (CsA), che viene rifornito in un ciclo di 3-4 cultura giorno. Per scopi di laboratorio CD40-stimolazione è fornito da NIH/3T3 cellule che esprimono CD40 ligando ricombinante umano (tCD40L NIH/3T3) ^5. Per evitare la contaminazione con le cellule non transfettate, espressione del ligando CD40 umano sulla trasfettate deve essere controllata regolarmente (Fig.2).

Dopo 14 giorni CD40-B colture cellulari costituiti da oltre il 95% delle cellule B puro e una espansione del CD40 delle cellule B con più di 65 giorni è spesso possibile senza alcuna perdita di funzione ^{1, 4.} Le cellule B CD40-in modo efficiente raccogliere, trasformare e antigeni presenti alle cellule T ^6. Non solo naϊve primo, ma anche di espandere le cellule T di memoria ^7,8. CD40-attivate le cellule B possono essere utilizzati per studiare l'attivazione delle cellule B, la differenziazione e la funzione. Inoltre, essi rappresentano uno strumento promettente per la vaccinazione terapeutica o preventiva contro i tumori ^9.

Protocollo

Il protocollo per la generazione di umani CD40 delle cellule B attivate da PBMC è diviso in due parti: la parte A dimostra la preparazione di ligando CD40 esprimere NIH/3T3 celle, che sarà usato come piatto legato cellule nutrici. Parte B descrive l'attuale B CD40-cultura.

A. Preparazione di cellule di alimentazione (tCD40L NIH/3T3)

Il NIH/3T3 tCD40L è un aderente murino linea cellulare di fibroblasti, che non dovrebbe mai diventare completamente confluenti. Le cellule sono quindi suddivisi due volte alla settimana. Coltura per più di 6 settimane non è raccomandato.

1. Rimuovere medio vecchio dalla coltura primaria con una pipetta sterile e lavare le cellule con 10 ml di PBS 1x. Aspirare il PBS dopo il lavaggio.
2. Aggiungere 4 ml di tripsina / EDTA in un centimetro 75 ² fiasco per 5-10 minuti a 37 ° C. Usa picchiettando leggermente per staccare le cellule.
3. Aggiungere 10 ml di medium di tipo selvatico e girevole con delicatezza.
4. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml con una pipetta sterile e girare le celle in basso a 225 xg per 5 min.
5. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 10 ml di medium di tipo selvatico. Contare il numero di cellulare di una aliquota della sospensione cellulare e preparare tre da 50 mL con il numero appropriato di cellule:
   1. 1,5 x 10 ⁶ cellule per subcolture
   2. 0,2 x 10 ⁶ cellule / pozzetto di irradiazione utilizzate nel CD40-B colture cellulari
   3. resto di congelare (se necessario).
6. Spin le cellule verso il basso a 225 xg per 5 min.
7. Rimuovere il surnatante.
   1. Per subcolture: risospendere 1,5 x 10 ⁶ cellule in 10 ml di tipo medio selvatici in un CM 75 ² fiasco coltura cellulare (cellule densità di 1,5 x 10 ⁵ cellule / ml), aggiungere G-418 [0,7 mg / ml] e incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO _2. Dividere le celle due volte alla settimana.
   2. Per la B CD40-coltura cellulare: Avete bisogno di 1,2 x 10 ⁶ cellule per un 6-pozzetti. Risospendere le cellule in terreno di tipo selvatico ad una densità di 0,1 x 10 ⁶ cellule / ml e irradiare li a 78 Gy. Tavola 2 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto e incubare loro a 37 ° C con 5% di CO _2. Utilizzare questa piastre preparate per la stimolazione delle cellule B quando tCD40L NIH/3T3 cellule sono aderenti (almeno 4 ore: controllare l'aderenza con il microscopio, non aspettare più di 24 ore per iniziare la stimolazione delle cellule B). (Continua con B.)

B. CD 40-B di coltura cellulare

I. Preparazione di PBMC per CD40-stimolazione (giorno 0):

Attenzione: prima di continuare a constatare che le cellule feeder siano aderenti. Aggiungere sempre soluzioni fresche di interleuchina-4 e ciclosporina A per il terreno di coltura immediatamente prima dell'uso.

1. Prendete PBMC, fresco o opportunamente scongelati. Risospendere PBMC due volte in 50 mL di PBS 1x di lavarli e spin down prima volta a 265 xg per 7 min e una seconda volta a xg 190 per 7 minuti per eliminare altre cellule. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 20 ml di PBS. Determinare il numero di cellule in una parte aliquota della sospensione cellulare.
2. Spin down quantità necessaria di cellule a 225 xg per 5 min. Per un 6-pozzetti 4 x 10 ⁶ cellule / pozzetto sono necessari, quindi 24 x 10 ⁶ cellule per piastra.
3. Rimuovere il supernatante e risospendere il PBMC con 1 x 10 ⁶ cellule / ml in B CD40-terreno di coltura fresco integrato con 50 U / mL di interleuchina-4 come un fattore di crescita e di 0,63 mg / ml ciclosporina A per prevenire conseguenza di cellule T (concentrazioni indicati si riferiscono a un mezzo ml di cultura!).
4. Rimuovere il surnatante da 6 pozzetti di pre-incubazione piatto con tCD40L NIH/3T3 cellule.
5. Lavare l'aderente tCD40L NIH/3T3 cellule con 2 ml di PBS per primo pozzo e in una seconda fase con 2 ml di CD40-B medio di lavaggio.
6. Delicatamente aggiungere 4 ml di sospensione PBMC (1 x 10 ⁶ cellule / ml) in ciascun pozzetto della piastra ben 6.
7. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO _2.
8. Il giorno 7, reculture le cellule (Continua al punto 3.2.).

II. Ricoltivazione di cellule CD40-B (7 ° giorno e poi ogni 3-4 giorni):

1. Cluster raccolta di cellule CD40-B da 6 pozzetti da risospendere con una pipetta da 10 mL e la piscina in un tubo da 50 ml.
2. Spin down a 225 xg per 7 minuti e sostituire completamente il sopranatante con CD40-B medio di lavaggio. Mentre conta la quantità delle cellule di una aliquota, girare la celle in basso a 225 xg per 5 minuti. Risospendere le cellule B CD40-CD40-B in terreno di coltura ad una concentrazione di 1 x 10 ⁶ cellule / ml.
3. Aggiungi soluzioni fresche di interleuchina-4 in una concentrazione di 50 U / mL e 0,63 mcg / mL ciclosporina A per la media.
4. Rimuovere il surnatante da un 6-pozzetti pre-incubate con tCD40L NIH/3T3 cellule.
5. Lavare le cellule aderenti con 2 ml di PBS per primo pozzo e in una seconda fase con 2 ml di CD40-B medio di lavaggio.
6. delicatamente aggiungere 4 ml (1 x 10 ⁶ cellule / ml) di sospensione CD40-B in ciascun pozzetto della piastra ben 6.
7. Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO ^2.
8. Cellule sottocultura di nuovo ogni 3-4 giorni per finire con elevata purezza umano CD40 delle cellule B attivate dopo un totale di 14 giorni.

C. Soluzione dei problemi - Che cosa succede se le cellule CD40-B non crescono?

1. Hai controllato di espressione ligando CD40 delle cellule alimentatore?
2. La piastra-bound cellule alimentatore utilizzato per la stimolazione non deve essere più di 24 ore?
3. È una possibile contaminazione con micoplasma?
4. È stata la interleuchina-4 soluzione utilizzata per la supplementazione appena scongelato e aveva l'attività biologica appropriata?
5. È stato aggiunto ciclosporina A nella concentrazione giusta?

Figura 1. Si prega di cliccare qui per una versione più grande della figura 1.

Figura 2. Si prega di cliccare qui per una versione più grande della figura 2.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alimentatore cellule wild type media		Alimentatore cellulare medio selezione
Reagente	Concentrazione	Reagente	Concentrazione
DMEM-Ham / F12		DMEM-Ham / F12
L-Glutammina	365 mg / ml	L-Glutammina	365 mg / ml
FBS	10%	FBS	10%
HEPES	10 mM	HEPES	10 mM
Gentamicina	15 mg / ml	Gentamicina	15 mg / ml
		G-418	0,7 mg / ml

CD40-B lavaggio medio		CD40-B terreno di coltura
Reagente	Concentrazione	Reagente	Concentrazione
IMDM		IMDM
L-Glutammina	584 mg / ml	L-Glutammina	584 mg / ml
HEPES	25 mM	HEPES	25 mM
Gentamicina	15 mg / ml	Gentamicina	15 mg / ml
		rh transferrina	50 mg / mL
		L'insulina rh	5 mcg / ml
		AB-Humanserum	10%

Reagente	Azienda	Il decreto n.
DMEM / Ham F12	PAA	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen Gibco ®	REF 21980-032
Dulbecco PBS (10x)	PAA	Nessun gatto H15-011
AB-siero umano	Invitrogen	Nessun gatto 34005100
olo-transferrina umana	Sigma	Nessun gatto T0665
Insulina umana	Sigma	Nessun gatto I2643
Gencin ®	Delta Select	Art. n. 7395800
Ricombinante umano interleuchina-4	Immunotools	Nessun gatto 11130045
Ciclosporina A	Novartis	Nessun gatto NDC 0078-0109-01
FBS	LONZA	Nessun gatto DE14-802C
HEPES Buffer	PAA	Nessun gatto S11-001
G-418 Solfato	PAA	Nessun gatto P02-012
Tripsina / EDTA (10x)	Invitrogen Gibco ®	REF 15400-054

Reagente	Azienda	Il decreto n.
Puntali sterili	Sarstedt
6 pozzetti	NUNC	Nessun gatto 140675
50mL tubo conico	BD Falcon ™	Nessun gatto 352070
Tessuto cultura fiasco	Sarstedt	Nessun gatto 83.1813.002