Lentivirus Produzione

Riepilogo

Per rendere lentivirus, vettori di DNA sono transfettate in 293 cellule umane. Dopo la raccolta e concentrando il surnatante, titolo del virus è determinata dalla espressione fluorescenza con un citometro a flusso.

Abstract

Interferenza dell'RNA (RNAi) è un sistema di silenziamento genico nelle cellule viventi. In RNAi, i geni omologhi in sequenza a breve RNA interferenti (siRNA) sono ridotti al silenzio a livello post-trascrizionale di stato. RNA tornante breve, precursori di siRNA, può essere espressa tramite lentivirus, consentendo RNAi in una varietà di tipi di cellule. Lentivirus, come il virus di immunodeficienza umana, sono in grado di infettare sia che divide e non divisione delle cellule. Ci descrivono una procedura che a lentivirus pacchetto. Imballaggio si riferisce alla preparazione di virus competente da vettori del DNA. Lentivirali sistemi di produzione vettoriali sono basati su un sistema 'split', in cui il genoma virale naturale è stata suddivisa in costrutti individuali plasmide helper. Questa divisione dei diversi elementi virale in quattro vettori separati diminuisce il rischio di creare una replica-virus in grado di ricombinazione casuale del genoma lentivirali. Qui, un vettore contenente i shRNA di interesse e di tre vettori imballaggio (p-VSVG, pRSV, pMDL) sono transitoriamente trasfettate in 293 cellule umane. Dopo almeno un periodo di 48 ore di incubazione, il surnatante contenente virus viene raccolto e concentrato. Infine, titolo del virus è determinata dalla giornalista (fluorescenti), espressione con un citometro a flusso.

Protocollo

Parte 1: Transfection di HEK 293 cellule di produrre lentivirus

* 24 ore prima della trasfezione, piatto 2,5 X 10 ⁶ celle in un piatto di 10 centimetri per una confluenza del 50-70% il giorno successivo.

1. Avviare questo protocollo preparando il DNA con la quale si verrà poi trasfezione proprio le cellule per fare virus. In primo luogo, diluire FuGENE 6 Transfection Reagent Roche, un reagente lipidi che compongono le cellule prendono il DNA. In un tubo da 1,5 ml, pipetta 30μl FuGENE 6 in 600ul mezzo privo di siero (SFDMEM). Fare attenzione a non lasciare FuGENE toccare il lato del tubo in condizioni di fornitura nel mezzo. Lasciate che questo FuGENE e mescolare SFDMEM e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
2. Nel tappo del tubo, mescolare 4 microgrammi lentivirale plasmide con 4 mg ogni 3 ^° generazione di vettori di imballaggio virale (pMDL, pRSV e pVSV-G). Il plasmide lentivirale contiene il DNA del virus si inserisce nel genoma di ogni cellula che infetta, mentre i vettori di imballaggio contengono geni per tutte le altre proteine ​​necessarie per fare un lentivirus.
3. Chiudere il coperchio e mescolare invertendo il tubo di un paio di volte.
4. Incubare per 15-20 minuti a temperatura ambiente.
5. Pipettare intero contenuto del tubo in 293 piastre. Mescolare delicatamente piastra inclinazione avanti e indietro.
6. Ritorno alle cellule di dell'incubatore e consentire la produzione virale di proseguire per 48-96 ore prima del raccolto.
7. Durante l'incubazione, le 293 cellule trascrivere il DNA di interesse da parte del plasmide lentivirale, creando una copia di RNA del costrutto lentivirali. Hanno anche trascrivere e tradurre i geni nei vettori imballaggio in proteine ​​virali. Queste proteine ​​procedere a fare virus contenente la versione di RNA del costruire lentivirali, che il virus si riverseranno trascrivere e inserire nel genoma di tutte le cellule che infetta.

Parte 2: Harvest lentivirali

1. Dopo il periodo di incubazione, le cellule prendono fuori dell'incubatore e utilizzare un usa e getta, siringa da 10 ml per rimuovere il supernatante, che ora contiene il virus. Ci saranno circa 10 ml di sopranatante.
2. Collegare un filtro 0.45μM siringa per la punta e filtrare il virus in un tubo Ultracentrifuga Beckman. Il filtro consente solo i virus, e non le cellule di passare.
3. Prima di gettare, incubare tutte le cellule che producono virus, piastre di coltura, siringhe e filtri nel 10% di candeggina per 45 minuti.

Parte 3: Concentrazione lentivirali tramite ultracentrifugazione

1. Carico provette in SW-41Ti o SW-28 secchi rotore.
2. Usa DMEM senza siero per bilanciare tutti i virus contenenti tubi a 0,2 g all'interno.
3. Tenuta chiusa secchi rotore e agganciarli sul rotore prima di mettere dentro il rotore ultracentrifuga
4. Spin il virus per 90 minuti in un'ultracentrifuga a 4 ° C a 25.000 giri al minuto in un SW-41Ti rotore o 24.000 rpm in un rotore SW-28.
5. In una cappa colture di tessuti, invertire i tubi a testa in giù a versare il surnatante in un contenitore contenente il 10% di candeggina.
6. Utilizzare un Kimwipe per assorbire il liquido in eccesso in tutto il pellet e invertire il tubo in un rack conveniente per non più di cinque minuti.
7. Per risospendere il pellet virale, utilizzare una punta filtro per aggiungere 100 ul di PBS sterile per il tubo, poi pipetta su e giù per circa 20 volte.
8. Lasciare il virus a 4 ° C durante la notte per completare la risospensione. Si può memorizzare prepara virale a 4 gradi per circa 1 settimana a -80 gradi per un massimo di un anno. Ricordate di trattare tutti i tubi vuoti con il 10% di candeggina prima di smaltimento.
9. Se si intende utilizzare la preparazione virale per più di una settimana 1, fanno aliquote minime di 5-20μl per futuri esperimenti e 1 aliquota del 3 per 5μl per la titolazione. Congelare e conservare le aliquote a meno 80.

Parte 4: Titolazione lentivirali in citometria a flusso

1. Il passo successivo consiste nel determinare il titolo virale mediante citometria di flusso. Questo metodo funziona solo nei casi in cui il plasmide lentivirale contiene un gene fluorescente reporter. L'idea è che quando il virus infetta una cellula, introduce il DNA lentivirale plasmide nel genoma di quella cella. La cellula infettata poi trascrivere e tradurre i geni che hai incluso nel plasmide lentivirale, e se hai incluso un gene fluorescente giornalista, le cellule infette si fluorescenza. Il livello di fluorescenza rappresenta la potenza, o titolo, del virus.
2. Per ogni titolo virale di essere titolati, diluire 3 ml di virus concentrati in 1,5 ml di mezzi completi (DMEM, pen-streptococco, glutammina, FBS).
3. In pozzi 1-6 in una singola riga di una piastra 96 ​​pozzetti, eseguire le seguenti diluizioni seriali: a tutti i 6 pozzi aggiungere 100 ml di DMEM completo dei media. Per il primo e aggiungere 100μl di media con nessun virus (questo è il vostro controllo senza macchia), al secondo e aggiungere 100 ml di virus diluito (che è equivalente a 1 ml di virus diluito), al terzo e aggiungere 100 uldel mix dal secondo pozzo, al quarto e 100 ml dal 3 così, al quinto e aggiungere 100μl dal pozzo 4, e al sesto e aggiungere 100 microlitri dal 5 bene. Finalmente prendere 100ul fuori dal pozzo 6 e scartare in candeggina. Una diluizione seriale è stata effettuata in cui ogni bene è la metà del volume del virus rispetto a quella precedente.
4. Portare il volume totale in tutti i pozzetti di 200μl. Notare che questi sono diluizioni solo suggerito, che dovrebbe funzionare bene per la titolazione dei virus più concentrata. Se il virus è bassa del titolo, o non concentrata che si possano desiderare per regolare il diluizioni.
5. Trattare qualsiasi virus inutilizzato diluito con 10% di candeggina per 45 minuti prima di scartare in un contenitore per rifiuti a rischio biologico.
6. Aggiungi ~ 15.000 sano, attivamente dividendo 293 cellule per ciascuno dei 6 pozzi. Un piatto unico a 96 e può essere usato per titolo 16 preparazioni virali.
7. Ritorno alle cellule di grado incubatore 37 con 5% di CO ₂ e permettere l'infezione di procedere per almeno 48 ore.
8. Dopo l'incubazione, le cellule vengono analizzate per l'espressione giornalista (nel nostro caso fluorescenza) con un citometro a flusso. Particelle virali sono quantificato mediante la percentuale di cellule fluorescenti per bene.

Calcolare il numero di unità infettive per ml con la seguente formula:

_{(Numero di cellule per bene il giorno di infezione delle cellule giornalista X positivo) X 1000}
^{______________________________________________________
ml di vettore aggiunto al bene}

Parte 5: Risultati Rappresentante:

Dopo una di 48 ore dopo la trasfezione periodo di incubazione, la piastra di 293 cellule dovrebbe essere di circa il 90% fluorescenti. Un'alta percentuale di cellule fluorescenti è indice di una elevata percentuale di cellule che producono virus.

Dopo la centrifugazione, il pellet virale è appena visibile quando risospendere. Questo è normale come il pellet è chiara e molto piccolo.

Nell'interpretazione dei risultati citofluorimetro, si noti che si può raggiungere solo titolo calcoli precisi quando infetta (fluorescenti), le cellule hanno ricevuto più di una integrazione virale per cellula. Al fine di garantire che questo è il caso, utilizzare le cellule con il tasso di infezione <15% per i calcoli. Cellule con tassi di infezione più elevati hanno probabilmente ricevuto più integrants virale per cellula. Le diluizioni suggerito al punto 2 dovrebbe produrre diversi campioni all'interno di questa gamma di infezione. Idealmente, usare diversi campioni di generare una trama di titolazione (linea retta) da cui si può calcolare il titolo finale, ma si può calcolare titolo utilizzando un unico campione, se necessario. Ci si può aspettare titolo di 1,0 x 10 ⁷ TU / ml per un-concentrato virus e 1,0 x 10 ⁸ TU / ml per virus concentrati.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.