L'uso di SC1 (Pluripotin) a supporto Mesc auto-rinnovamento in assenza di LIF

Riepilogo

SC1 funzioni attraverso la doppia inibizione di Ras-GAP e ERK1. Abbiamo testato la funzione di SC1 nel sostenere ES cellule del mouse di auto-rinnovamento, in assenza di LIF e ha dimostrato che SC1 è in grado di mantenere auto-rinnovamento delle colture di cellule ES topo.

Abstract

Topo staminali embrionali (ES), le cellule sono coltivate in modo convenzionale con fattore inibente la leucemia (LIF) per mantenere l'auto-rinnovamento.

Protocollo

1. Preparazione delle piastre alimentatore MEF

1. Un giorno prima che le cellule ES coltura, scongelare un flaconcino del combustibile irraggiato E14.5 CF-1 alimentatore cellule MEF (vedi la nostra procedura su come scongelare le cellule ES).
2. Piastra le cellule MEF alimentatore ad una densità di 10.000 cellule / pozzetto in un piatto ben 12. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% di CO _2. MEF cellula media: DMEM supplementato con 10% ES-PBS 1X 1X glutammina e aminoacidi non essenziali.

2. Manutenzione di auto-rinnovamento delle cellule ES mouse

1. Staccare le cellule ES con tripsina. Seed le cellule ad una densità di 50.000 cellule / pozzetto sui piatti MEF precedentemente preparato alimentatore in terreni di coltura (MEM Knockout integrata con il 15% KSR, 4 mM L-glutammina, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali e 1X BME) integrata con SC1 alla concentrazione desiderata (abbiamo usato 100 nm, 300 nm e 1 micron). Abbiamo anche aggiunto un controllo positivo che è stato integrato con 1000 μ / ml di LIF. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Coltura le cellule a 37 ° C e 5% di CO ₂ per 3-4 giorni in ogni passaggio. Aggiornare i media ogni 48 ore.
3. Cellule passaggio 1:10-1:15 con tripsina per mantenere una densità simile a quella della densità di semina iniziale. Dopo 5 passaggi, le cellule possono essere esaminati per l'espressione di marcatori tipici pluripotenza utilizzando immunocitochimica.

3. Esame immunocitochimica di marcatori pluripotenza

1. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS.
2. Fissare le cellule con 500 ml di fissativo per 20 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS.
4. Blocca legame non specifico con 500 microlitri di buffer bloccando per un'ora a temperatura ambiente.
5. Incubare le cellule con 250 microlitri di anticorpo specifico primario (abbiamo usato Nanog, Sox2, SSEA1, e Oct4 alle diluizioni seguente: 1:500, 1:2000, 1:500 e 1:500)
6. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS.
7. Incubare le cellule con 250 microlitri di anticorpo secondario per due ore a temperatura ambiente, mantenendo al riparo dalla luce (abbiamo usato asino anti-topo coniugati con Alexa Fluor ® 555 a 1:2000 e asino anti-coniglio coniugato con Alexa Fluor ® 488 a 1 : 2000).
8. Lavare le cellule delicatamente per tre volte con PBS.
9. Aggiungi DAPI (concentrazione finale 1 mg / ml) per l'ultimo lavaggio e incubare 5 minuti per visualizzare nuclei.
10. Analizzare le cellule al microscopio a fluorescenza.

4. Rappresentante dei risultati:

1. Morfologia risultati:

Topo cellule staminali (ESC R1) sono stati coltivati ​​su cellule alimentatore MEF in presenza di uno o LIF SC1 per sostenere auto-rinnovamento in uno stato indifferenziato. Dopo il secondo passaggio, la differenziazione potrebbe essere osservato nelle cellule senza LIF o SC1 (controllo negativo) e dopo 5 passaggi essenzialmente non indifferenziato colonie sono state osservate. LIF (controllo positivo) colonie trattate è rimasto in uno stato indifferenziato tutto il 5 passaggi cellula. Cellule trattate con SC1 a concentrazioni di 300 Nm o 100 nM anche rimasto indifferenziato dopo 5 passaggi, tuttavia, le cellule trattate con 1 mM SC1 morte cellulare sperimentato dopo il passaggio quarto. (Fig. 2 della nota app) La tabella 1 riassume le osservazioni morfologiche.

2. Espressione di marcatori pluripotenza

Le cellule staminali del mouse effettuato per 5 passaggi sono stati fissati ed esaminate mediante immunocitochimica per SSEA1, Oct4, Sox2 e Nanog. Espressione marcatore era simile alle cellule mantenute in LIF. (Fig. 3 e 4 della nota applicazione)

Figura 1: confronto Morfologia di cellule mantenute in LIF o SC1. Nessuna differenza è stata osservata nella morfologia.

Figura 2 e Figura 3: Nanog, SSEA1, Sox2 e Oct4 colorazione delle cellule ES mantenuto con SC1 o LIF (fig. 4 della nota app). Cellule mantenute in SC1 spettacolo simile espressione pluripotenza marcatore per le cellule mantenute in LIF.

Tabella 1

	Controllo Negativo	LIF controllo positivo	SC1 1um	SC1 300 nm	SC1 100 nM
1 Passage	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES
Passaggio 2	Alcuni morfologia differenziata	E normaleS morfologia delle cellule	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES
Passaggio 3	Maggior parte delle cellule differenziate	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES
Passaggio 4	Nessun ESC colonie	Normale morfologia delle cellule ES	La morte cellulare osservata	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES
Passaggio 5	differenziato	Normale morfologia delle cellule ES	La morte cellulare osservata	Normale morfologia delle cellule ES	Normale morfologia delle cellule ES

Discussione

Il SC1 piccola molecola può essere utilizzata per mantenere auto-rinnovamento con uno stato indifferenziato delle cellule ES mouse. Prima di utilizzare su una linea cellulare non testato, comunque, dovrebbe essere titolato per determinare la concentrazione ottimale. Per esempio, abbiamo testato tre concentrazioni sulla cellula del mouse ES linea ESC R1. 100 nM e 300 nM concentrazioni sono stati in grado di sostenere le cellule staminali embrionali del mouse, invece, una concentrazione 1 mM era tossico.

SC1 può essere utilizzato anche sotto alimentatore senza condizioni.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279