Dissezione di 6,5 embrioni di topo dpc

Riepilogo

Isolamento di post-impianto di embrioni allo stadio permette di studiare e analizzare patterning gene cellulari lignaggio processi decisionali durante lo sviluppo embrionale, ma corretta dissezione dell'embrione precoce può essere difficile. Questo protocollo descrive un metodo per isolare primi primitivo-striscia-stadio embrioni (~ 6,5 giorni post coitum [dpc]).

Abstract

Analisi dei modelli di espressione genica durante le prime fasi di sviluppo embrionale dei mammiferi in grado di fornire importanti indizi circa la funzione del gene, l'interazione cellula-cellula e meccanismi di segnalazione che patterning guida embrionale. Tuttavia, la dissezione dell'embrione mouse dal decidua poco dopo l'impianto può essere un procedimento impegnativo e dettagliato passo-passo la documentazione di questo processo è carente.

Qui mostriamo come post-impianto (6,5 DPC) sono isolate da embrioni prima dissezione nell'utero di un topo gravide (rilevamento del tappo vaginale è stato designato giorni 0,5 coitum poist) e poi sezionare l'embrione da decidua materna. La dissezione della membrana Reichert è descritto così come la rimozione del cono ectoplacental.

Protocollo

Dissezione di organi riproduttivi di un topo femmina

1. Animali gravidi sono eutanasia da CO ₂ asfissia con gas compresso.
2. L'animale giaceva supino sul tampone assorbente e immergerlo in etanolo al 70% per ridurre il rischio di contaminare la dissezione con i capelli del mouse.
3. Pizzicare la pelle e fare una piccola incisione laterale alla linea mediana con regolare forbici chirurgiche. Tenere la pelle saldamente sopra e sotto l'incisione e tirare la pelle a parte verso la testa e la coda per esporre l'addome.
4. Afferrare il peritoneo con una pinza e taglio per esporre la cavità addominale.
5. Individuare gli organi riproduttivi nella regione dorsale della cavità del corpo: due corna uterine, l'ovidotto e le ovaie.

Primitivo Streak stadi (6,5 DPC) Dissection

1. Rimuovere il corno uterino afferrando l'utero al di sotto del ovidotto e tagliarlo libero lungo il mesometrium. Luogo utero sezionato in ghiaccio PBS freddo.
   
   
   
   Figura 1
   
   
2. Separare ogni embrione, tagliando tra siti d'impianto lungo corno uterino.
   
   
   
   Figura 2
   
   
   
3. Afferrare il rivestimento uterino muscolare facendo scorrere orologiaio pinza tra lo strato muscolare e il tessuto circostante decidua avvolto. Staccare lo strato muscolare, esponendo il decidua.
   
   
   
   Figura 3
   
   
4. Clip di una porzione della decidua esposti al vertice (circa 1 / 5 del tessuto decidua), che esporrà la punta midventral o distale dell'embrione racchiuso.
   
   
   
   Figura 4
   
   
5. L'embrione può essere sborsato con le punte delle pinze. Pierce decidua con una pinza che circonda l'embrione e pinze aperto a strappare decidua a parte.
   
   
   
   Figura 5
   
   
6. Una volta embrione viene rimosso, membrana Reichart può essere ancora attaccato così come il cono ectoplacental (trofoblasto). L'embrione può essere ulteriormente sezionato da dissezione accurata.
   
   
   Figura 6
   

Discussione

Post-impianto nel topo si verifica tra 4,5 dpc e la nascita. Questo metodo può essere applicato dissezione, essenzialmente come descritto, per isolare prima o dopo gli embrioni scena al 5,5-8,5 dpc.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5130	2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010	2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x)	Reagent	Invitrogen	14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS	Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Tool	Fisher Scientific	08-940
Pregnant female mice	Animal
Dissecting Microscope	Microscope