È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Method Article
Neurexins e neuroligins sono membrane dei neuroni proteine di adesione che svolgono ruoli essenziali nella differenziazione e la trasmissione sinaptica. Neuroligin mutanti carenti di C. elegans Sono difettosi nel rilevare la forza osmotica, ma quando contengono anche una mutazione nel gene che codifica neurexin, si riprendono il fenotipo wild type.
Neurexins e neuroligins sono molecole di adesione delle cellule presenti nelle sinapsi eccitatorie e inibitorie, e sono tenuti per un corretto funzionamento della rete neuronale 1. Queste proteine si trovano al membrane presinaptico e postsinaptico 2. Studi condotti su topi indicano che neurexins e neurologins hanno un ruolo essenziale nella trasmissione sinaptica 1. Recenti studi hanno dimostrato che le connessioni neuronali alterate nel corso dello sviluppo del sistema nervoso umano potrebbe costituire la base della eziologia di numerosi casi di disturbi dello spettro autistico 3.
Caenorhabditis elegans potrebbe essere utilizzato come uno strumento sperimentale per facilitare lo studio del funzionamento dei componenti sinaptica, per la sua semplicità per la sperimentazione di laboratorio, e dato che il suo sistema nervoso e il cablaggio sinaptica è stato pienamente caratterizzato. In C. Elegans NRX-1 e NLG-1 geni ortologhi di uomo e NRXN1 NLGN1 geni che codificano neurexin-alfa-1-1 e neuroligin proteine, rispettivamente. Negli esseri umani e nematodi, l'organizzazione di neurexins e neuroligins è simile rispetto a domini funzionali.
Il capo del nematode contiene il amphid, un organo sensoriale del nematode, che media le risposte a stimoli diversi, tra cui la forza osmotica. Il amphid è composto da 12 neuroni bipolari con dendriti sensoriali ciliate e un assone terminale presinaptico 4. Due di questi neuroni, chiamato ASHR e ASHL sono particolarmente importanti in osmotica funzione sensoriale, rilevando idrosolubili repellenti con elevata resistenza osmotica 5. I dendriti di queste due neuroni allungare fino alla punta della bocca e gli assoni estendere all'anello nervose, dove effettuare i collegamenti sinaptici con altri neuroni determinare la risposta comportamentale 6.
Per valutare le implicazioni di neurexin e neuroligin in alto evitamento forza osmotica, ci mostrano la diversa risposta di C. elegans mutanti difettosi in NRX-1 e NLG-1 geni, usando un metodo basato su un anello di fruttosio 4M 7. I fenotipi comportamentali sono stati confermati utilizzando specifici cloni RNAi 8. In C. elegans, il dsRNA necessaria per attivare RNAi può essere somministrato per alimentazione 9. La consegna dei dsRNA attraverso il cibo induce l'interferenza di RNAi del gene di interesse permettendo così l'identificazione di componenti genetiche e percorsi di rete.
1: test di evitamento osmotica.
2: Generazione di vermi knockdown alimentando RNAi.
3: I ceppi utilizzati.
Il C. elegans ceppi utilizzati in questo lavoro sono riportati nella tabella 1. Ceppi mutanti erano fuori incrociata contro N2 selvaggio - Tipo di almeno quattro volte per rimuovere i mutazioni casuali che avrebbero potuto essere generati durante il protocollo di mutagenesi.
. OP50 E coli ceppo è stato suppliied da Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA E.coli HT115 (DE3) con il plasmide pL4440 portando NRX-1 (JA: C29A12.5). NLG e-1 (JA: C40C9.5 frammenti di geni) sono stati forniti dal Dott. Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biologia del Desarrollo (Abd), CSIC Universidad Pablo Olavide, Siviglia, Spagna.
4: I risultati rappresentativi.
Risultati illustrativo sono rappresentati nelle figure 1 e 2. Dieci animali di ogni ceppo e un minimo di tre esperimenti replica sono state effettuate.
Figura 1. Esperimenti di comportamento di evitamento osmotica.
Ceppi di controllo e NRX-1 (ok1649 e tm1961) mutantworms V carenti rispondere invertendo indietro quando incontrano una barriera osmotica (4M fruttosio). NLG-1 (ok259 e tm474) X mutanti non riescono a rilevare questa barriera. Doppi mutanti carenti di NLG-1 e NRX-1, ceppi CRR21 (ok1649; ok259) VX e CRR23 (tm1961; ok259) VX recuperato il fenotipo wild type. Il simbolo * indica differenze significative (p ≤ 0,001) da t-student test, nella risposta di ogni sforzo per la N2 Bristol wild-type da t-studente di prova
Figura 2. Gli esperimenti con i vermi knockdown alimentando RNAi.
E.coli HT115 (DE3) trasformato con vuoti vettore pL4440 o contenente un frammento corrispondente ai geni bersaglio NRX-1 o NLG-1 sono stati utilizzati per ceppi di vite senza fine alimentato diverse. Il simbolo * indica differenze significative (p ≤ 0,001) da t-student test, nella risposta del ceppo N2 alimentato con i batteri portando la pL4440 vettore con un frammento intese a promuovere l'NLG-1 gene in confronto con il ceppo N2 alimentato con vuoto pL4440 vettore .
Neurexins e neuroligins svolgono ruoli fondamentali nella trasmissione sinaptica 11 e la differenziazione delle connessioni sinaptiche 12. Entrambe le molecole sono stati identificati come geni candidati per l'autismo 13,14.
In questo video vi mostriamo un metodo semplice che ci permette di studiare l'effetto di geni che influenzano la risposta osmotica evitare in C. elegans. Neuroligin mutanti carenti sono difettosi nel rilevare la forza osm...
Vorremmo ringraziare il dottor Antonio Miranda-Vizuete per il suo prezioso aiuto. Ci piace anche esprimere la nostra gratitudine a Salma Boulayoune e Isabel Caballero per una valida assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione della Junta de Andalucía (BIO-272). Questa ricerca è stata effettuata in accordo con le leggi vigenti che disciplinano la sperimentazione genetica in Europa.
Tabella 1. C. elegans ceppi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tensione | Gene | Allele | Fonte |
Bristol N2 | - | - | aCGC |
VC228 | NLG-1 | ok259 | CGC |
FX00474 | NLG-1 | tm474 | bNBP-GIAPPONE |
VC1416 | NRX-1 | ok1649 | CGC |
FX1961 | NRX-1 | tm1961 | NBP-GIAPPONE |
NL2099 | RRF-3 | pk1436 | CGC |
CRR21 | NRX-1; NLG-1 | ok1649; ok259 | Questo lavoro |
CRR22 | NRX-1; NLG-1 | tm1961; ok259 | Questo lavoro |
a. Caenorhabditis Genetic Center, Università del Minnesota, USA.
b. Progetto nazionale per la Bioresource sperimentale degli animali "nematode C. elegans". Tokyo donna Medical University, in Giappone.
Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi AutorizzazioneThis article has been published
Video Coming Soon