Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti

Riepilogo

Qui vi mostriamo come fare retro-orbitale iniezione in zebrafish adulti.

Abstract

Trattamento farmacologico degli animali tutto è uno strumento essenziale in qualsiasi sistema modello per studi di genetica e chimica farmacologica. Per via endovenosa (ev) è spesso la forma più efficace e non invasiva di consegna di un agente di interesse. Nel pesce zebra (

Protocollo

Parte 1. Preparazione del materiale di iniezione

1. Tg (globina: GFP) celle:
2. Bleed pesce adulto donatore utilizzando punta della pipetta 10ul rivestito in eparina (1unit/ul) a pescare puntura dietro branchia.
3. Aspirare globuli rossi e dispensare nel buffer di cella (0.9x PBS + 5% FBS + 1% Pen / Strep).
4. Cellula sospensione filtro su mesh 40uM e determinare la concentrazione di cellule utilizzando emocitometro come precedentemente descritto da LeBlanc et al.
5. Spin down e risospendere in buffer cella a concentrazione desiderata in modo tale che il volume di iniezione finale non è più di 5UL. Qui iniettare 1,5-2000000 cellule / destinatario.
6. Per le, destrano Texas Red ®, sciogliere il colorante in DPBS per una concentrazione di iniezione finale di 10-12 mg / mL. Piano per iniettare 4 uL per pesce.

Parte 2. Iniezione

1. Anestetizzare pesce in tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml pesci d'acqua).
2. Lavare Hamilton siringa 3-4 volte prima dell'iniezione utilizzando etanolo al 70%. Lavare 3-4 volte con DPBS 0.9x.
3. Luogo pesce lato dorsale e rivolta a destra sulla spugna umida.
4. Tenere la siringa Hamilton con la mano destra e con il dito indice sullo stantuffo. Delicatamente stabilizzare il corpo del pesce con la mano sinistra.
5. La posizione della lancetta con lo smusso rivolto verso l'alto in modo tale che se l'occhio del pesce s fosse un orologio, l'ago sarebbe indicando la posizione 7:00 e con un angolo di 45 gradi per il pesce (figura 1).
6. Inserire delicatamente l'ago 1-2 mm in posizione 07:00 e lentamente spingere il pistone.
7. Permettono di recuperare il pesce in acqua dolce E3.
8. Lavare ago, come descritto sopra, tra le iniezioni di reagenti diversi.
9. Flick soluzione cellula per risospendere le cellule ogni pochi minuti per evitare grumi di cellule.
10. Mantenere il flusso di pesce per 1 settimana con cambi d'acqua ogni giorno per evitare l'infezione. Noi mantenere i pesci in acqua terapia intensiva per questo periodo (cappotto stress da 10 ml + 5 ml + pemafix melafix 5mL per 38 litri di acqua E3).

Parte 3. Rappresentante Risultati

Quando eseguito correttamente, è possibile visualizzare materiale iniettato se è stato etichettato in qualche modo. Per esempio, Tg (globina: GFP) globuli rossi dovrebbe essere visto sotto un microscopio a fluorescenza dissezione circola nei vasi dei pesci destinatario casper subito dopo l'iniezione, come illustrato in figura 2. Allo stesso modo, l'iniezione di un destrano 70kDa, coniugato con Texas Red ® possono essere visualizzati nel sistema vascolare del pesce trasparente immediatamente successivo retro-orbitale di iniezione (figura 3). Cellule renali fluorescenti da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore può anche essere iniettato retro-orbitalmente in pesci irradiati destinatario casper. Queste cellule finalmente a casa per il midollo destinatario (figura 4a) e può quindi andare a ripopolare il rene dopo diverse settimane (figura 4b).

Se l'iniezione è troppo bassa o l'angolo dell'ago bypassa il retro-orbitale cavità dei seni venosi, materiale iniettato può essere visualizzata pooling intorno all'occhio o che scorre fuori di esso. In alternativa, se l'iniezione è troppo profondo, pesce possibile che si verifichino danni ai tessuti o sanguinamento eccessivo, anche se può ancora recuperare. Quando eseguito correttamente, la mortalità dopo retro-orbitale di iniezione deve essere inferiore al 5% del totale pesce iniettato e il successo di consegna alla circolazione sanguigna dovrebbe essere superiore al 90% del totale pesce iniettato.

Figura 1: Illustrazione di retro-orbitale tecnica di iniezione. L'occhio destro del pesce è rappresentato come un orologio analogico in cui l'orologio sette o posizione corrisponde al punto d'iniezione corretta.

Figura 2: Tg (globina: GFP) globuli rossi circolanti nei vasi della coda di un pesce adulto casper tre giorni dopo la retro-orbitale iniezione.

Figura 3: iniezione di successo di una 70kDa destrano coniugato con Texas Red ® usato come colorante fluorescente produce vascolarizzazione nei pesci adulti trasparente, Casper ed è facilmente visualizzati utilizzando standard di tutta la microscopia a fluorescenza animale.

Figura 4a: Tre giorni successivi retro-orbitale iniezione di cellule intere midollo rene da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore, le cellule possono essere visualizzati homing al midollo reni del combustibile irraggiato pesce destinatario casper adulti.

Figura4b: Quattro settimane dopo la retro-orbitale iniezione di cellule intere midollo rene da Tg (β-actina: GFP) pesci donatore, il ripopolamento del rene destinatario con verde cellule renali di tutto midollo del donatore possono essere visualizzati in irradiati pesce destinatario casper adulti.

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Discussione

Retro-orbitale iniezione in zebrafish adulto offre la massima efficienza della consegna del materiale iniettato alla circolazione sanguigna con la più bassa incidenza di mortalità. A causa della natura del punto di iniezione, la puntura sembra guarire in fretta, diminuendo l'insorgenza di infezioni e la quantità di perdita di sangue. Il sito può anche essere iniettato ripetutamente nel corso di un breve periodo di tempo per iniezioni giornaliere di farmaci, per esempio.

Grandi quanti...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	2106	Preweighed vial of 300 USP units
Tricaine-S	Western Chemical		MS-222
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Dextran, Texas Red®	Molecular Probes, Life Technologies	D1830
E3			5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2
Microliter Syringe	Hamilton Co	80300	701N 10uL SYR (26s/2”/2)