Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto

Riepilogo

Un metodo per isolare specifici tipi cellulari da materiale vegetale è dimostrata. Questa tecnica utilizza le linee marcatore transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti in particolari tipi di cellule, cellulari dissociazione e fluorescenza separazione delle cellule attivate. Inoltre, una configurazione di crescita è stabilito qui che facilita il trattamento delle Arabidopsis thaliana Piantine prima della separazione delle cellule.

Abstract

Ad alta risoluzione, il tipo specifico di cellule analisi dell'espressione genica migliora notevolmente la comprensione della regolazione dello sviluppo e delle risposte agli stimoli ambientali in ogni organismo multicellulare. Ibridazione in situ e la visualizzazione gene reporter può entro certi limiti essere utilizzate a tal fine, ma per alta risoluzione quantitativa RT-PCR o high-throughput a livello di analisi del trascrittoma l'isolamento di RNA da particolari tipi di cellule è necessaria. Dissociazione del tessuto cellulare che esprime un marcatore fluorescente proteina in un tipo cellulare specifico e successivo ordinamento fluorescenza cellulare attivato (FACS) permette di raccogliere quantità sufficienti di materiale per l'estrazione di RNA, cDNA analisi sintesi / amplificazione e microarray.

Un ampio insieme di cellule tipo-specifici linee giornalista fluorescente è disponibile alla comunità di ricerca delle piante. In questo caso, due linee marcatore della radice Arabidopsis thaliana sono utilizzati: P _SCR:: GFP (endoderma e centro quiescente) e P _WOX5:: GFP (centro di riposo). Un gran numero (migliaia) di piantine sono cresciute idroponica o su piastre di agar e raccolte di ottenere abbastanza materiale radice per ulteriori analisi. Cellulari dissociazione di materiale vegetale è ottenuta per digestione enzimatica della parete cellulare. Questa procedura si avvale di alta osmolarità indotta plasmolysis e cellulasi disponibili in commercio, pectinasi e emicellulasi di rilasciare protoplasti in soluzione.

FACS di cellule GFP-positive si avvale della visualizzazione del verde rispetto al rosso di spettri di emissione protoplasti eccitati da un laser a 488 nm. GFP-positive protoplasti si distinguono per il loro rapporto è aumentato di verde al rosso di emissioni. Protoplasti sono generalmente ordinati direttamente nel tampone di estrazione di RNA e conservati per l'ulteriore elaborazione in un secondo momento.

Questa tecnica si rivela essere semplice e praticabile. Inoltre, è dimostrato che può essere usata senza difficoltà per isolare un numero sufficiente di cellule per l'analisi del trascrittoma, anche per tipi di cellule molto scarse (ad esempio le cellule quiescenti centro). Infine, una messa a punto di crescita per piantine di Arabidopsis è dimostrato che permette di trattare semplice delle piante prima della separazione delle cellule (ad esempio per il tipo specifico di cellule analisi delle risposte di stress biotici e abiotici). Supplementari potenziali usi per FACS di protoplasti vegetali sono discussi.

Protocollo

1) Preparazione del materiale vegetale

1. Protoplasti può essere derivato da molte specie vegetali e tessuti diversi, a condizione che il giusto mix di parete cellulare enzimi è utilizzato ^1. Prima di un vero e proprio esperimento è intrapreso, una piccola digestione del materiale è consigliabile al fine di valutare l'efficienza protoplasting del tessuto, enzimi, ecc e per stimare la percentuale delle cellule positive per l'ordinamento delle cellule. Qui, protoplasti derivati ​​dalle radici di piantine di Arabidopsis thaliana, che cellule di tipo specificamente esprimere la proteina verde fluorescente (GFP) sono utilizzati. L'endoderma e il centro di quiescenza sono contrassegnati da P _SCR:: GFP e il centro quiescente da P _WOX5:: GFP ^2,3 (Figura 1).
2. Piantine sono cresciute in idroponica phytatrays (Sigma; Figura 2a) su un filtro di nylon (250 mesh micron; NITEX) che permette di crescere attraverso le radici nel terreno di crescita (0,22% w / v Murashige e medie Skoog Basal [sigma], 1% w / v di saccarosio, 0,05% w / v MES [2 - (N-morfolino) Acido etano], pH 5,7 con KOH). In alternativa, le piante possono essere coltivate in cima ad un filtro di nylon (100 mesh micron) in posizione verticale piastre di agar 1% (Figura 2b).
3. L'uso dei filtri di cui sopra non solo aiuta nella raccolta delle radici, facilita anche facile trattamento aggiuntivo delle piantine, se lo si desidera. I filtri permettono le piantine da trasferire in massa per phytatrays nuovi o piastre di agar integrato con un catalizzatore di interesse. Per esempio, il set up phytatray è stato usato per cellulare di tipo specifico per l'analisi della risposta trascrizionale al trattamento azoto in piantine di Arabidopsis ^4.
4. Assicurarsi che il vostro microscopio marcatore fluorescente è correttamente espresso (soprattutto quando si utilizza l'opzione di trattamento, come la cellula tipo-specifici marcatori stessi potrebbe essere influenzata dal trattamento). In questo caso, piantine sono controllati al microscopio a fluorescenza (Nikon; Figura 1). Da notare che delle cellule tipo-specifici linee marcatore fluorescente dovrebbe essere caratterizzata inizialmente sotto un microscopio confocale a determinare esattamente quali tipi di cellule sono marcati e determinano variabilità nell'espressione.

2) Preparazione della soluzione protoplasting

1. Sciogliere 1,25% w / v Cellulase (Yakult), 0,3% w / v Macerozyme (Yakult), 0,4 M D-mannitolo, 20 mM MES e 20 mM KCl (da uno stock 1 M) in acqua demineralizzata e regolare il pH a 5,7 con 1 M Tris / HCl pH 7.5. Questa soluzione sarà leggermente torbido.
2. Riscaldare la soluzione a 55 ° C per 10 minuti (la soluzione diventa chiara) e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente prima di aggiungere 0,1% w / v BSA (albumina di siero bovino), 10 mM CaCl _2, e 5 mM β-mercaptoetanolo .

3) La raccolta e protoplasting del materiale vegetale

1. Le radici vengono raccolte a loro raschiando via la rete di nylon con un bisturi e depositati in un pallone contenente la soluzione protoplasting. In generale, 10 ml di soluzione protoplasting è utilizzato per 1.500 radici piantina.
2. Agitare delicatamente i palloni (75 giri) a temperatura ambiente per un'ora. Un tempo di incubazione più lungo può aumentare la resa protoplasti, ma anche aggiungere l'effetto di protoplasting stesso sull'espressione genica.
3. Filtrare la soluzione protoplasti con un colino cellula 40 micron (BD Falcon) e dividere la soluzione più conica provette da 15 ml (BD Falcon).
4. Gira i tubi in un basculanti centrifuga per 10 minuti a 500 G. noti che questa velocità di centrifugazione dipenderà dal tipo di protoplasti utilizzati, la loro fragilità e la quantità di detriti cellulari prodotte durante il trattamento enzimatico.
5. Eliminare la maggior parte surnatante, risospendere il protoplasti nella soluzione rimanente e verifica di microscopio (Figura 3).
6. Fare uso di un emocitometro di stimare il numero e la densità di protoplasti. La densità delle cellule determina la velocità di iniezione del campione, il tasso di eventi al secondo e quindi il tempo totale necessario per ordinare le cellule al FACS (vedere anche paragrafo 4.3).
7. 3.7) In entrambi i casi procedere direttamente al FACS o lavare e risospendere il protoplasti in una soluzione di incubazione, come W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 5 mM MES, aggiustare il pH a 5,7 con KOH) o la soluzione protoplasting senza l' aggiunto enzimi. Specialmente quando esaminano i cambiamenti trascrizionali, è di fondamentale importanza per ridurre al minimo l'esposizione dei campioni a condizioni che potrebbero influenzare l'espressione genica, come la modifica del buffer sono conservati i protoplasti a. Si raccomanda pertanto di mantenere il protoplasti in soluzione protoplasting e procedere FACS per il più presto possibile.

4) Ordinamento fluorescenza cellulare attivo di protoplasti

1. Accendere e preparare il cell sorter. Qui, un FACSAria (BD) è usato.
2. Impostazione di un flusso di flusso con un 100 & mu; ugello m ed una pressione di 20 psi guaina.
3. La densità delle cellule e la velocità di iniezione del campione può essere regolata per il particolare esperimento basato sul fatto che una resa migliore o più veloce di velocità raggiungibile è desiderata. Abbiamo ordinati con successo con densità fino a 10.000.000 cellule / ml.
4. Utilizzare l'opzione agitazione campione sul FACS per evitare la sedimentazione dei protoplasti. Se intasamento del FACS è un problema, ci sono tre possibili passi risoluzione dei problemi: 1. Eseguire un campione-line backflush. 2. Diluire la sospensione di protoplasti per ridurre la densità. 3. Pulire la soluzione protoplasti ripetendo la fase di filtrazione (3.3) dopo la centrifugazione e la risospensione.
5. Preparare l'apparato per misurare la dispersione in avanti (FSC), side scatter (SSC) ed emissione a 530/30 nm per GFP e nm 610/20 per lo spettro autofluorescenza rosso (RSA), dopo l'eccitazione da un laser a 488 nm. Questi sono in sostanza gli unici parametri utilizzati per isolare GFP-positive protoplasti. Qui, le regolazioni di tensione sono state le seguenti: FSC - 60V, SSC 250V, 350V GFP e RSA 335V. Notare che le impostazioni ottimali di tensione sarà diverso per ogni FACS e sarà nemmeno bisogno di essere regolata per tutta la durata del cell sorter.
6. Inizia la creazione di un dotplot per scatter scatter in avanti rispetto a lato. Applicare le impostazioni di tensione in modo che gli eventi misurati sono al centro del complotto.
7. Successivamente, creare un dot plot di segnali di fluorescenza verde contro rosso. Applicare le impostazioni di tensione in modo che gli eventi misurati resa una popolazione centrato diagonale al complotto quando si guarda una wild-type (non GFP) sospensione di protoplasti. Una sospensione di protoplasti derivata da una linea di marcatore GFP produce una popolazione chiara di verde fluorescente eventi mai visti in campioni di wild-type.
8. Impostare vincoli di compensazione per registrare per sovrapposizione spettrale tra GFP e RSA. Corretto le impostazioni vincolo compensazione permettere una migliore separazione della GFP-positive protoplasti dal non-GFP protoplasti e detriti. I vincoli usato qui sono le seguenti: RSA, meno 17,91% GFP.
9. Impostare un cancello per identificare GFP-positive eventi, un controllo negativo di non-GFP protoplasti dovrebbe essere usata per aiutare a definire i confini cancello (Figura 4).
10. Implementare un cutoff dispersione in avanti in modo da lasciare piccoli detriti fuori dell'analisi. Visualizza la GFP-positive eventi nel complotto contro FSC SSC per aiutare a determinare il posizionamento del taglio. Qui, il cut-off è stato fissato a 5.000. Si noti che il FACS conterà detriti come ordinare gli eventi e un campione con alti livelli di detriti potrebbero avere un diverso eventi GFP positive per cento del previsto. Questo non è necessariamente un problema. Tuttavia, i detriti più nel campione, il più a lungo l'ordinamento prendere.
11. A seconda della sperimentazione e l'abbondanza del tipo di cellula da analizzare, impostare la modalità di precisione FACS sia per la resa ottimale o purezza ottimale delle cellule ordinati.
12. Per l'estrazione di RNA, preparare tubi di raccolta (1,5 ml tubi microcentrifuga) con la giusta quantità di tampone di estrazione dell'RNA. Con questa impostazione, 20.000 eventi ordinamento produrrà un volume totale di circa 100 l che sono stati ordinati in a 350 l di tampone di estrazione (RNeasy micro kit, QIAGEN). Mescolare i campioni dopo il completamento del tipo di sospensione cellulare possono mettere in cima.
13. Conservare i campioni o procedere direttamente alla RNA. Analisi di microarray di successo sono stati preformati con l'RNA estratto da un minimo di 500 eventi ordinati. Qui, abbiamo usato un kit RNeasy estrazione micro (QIAGEN), il WT-Ovation Pico sistema di amplificazione di RNA e FL-cDNA Ovation Biotina Modulo V2 (NuGen).

Rappresentante Risultati

Un phytatray di circa 1.500 di una settimana-vecchio P _SCR:: piantine GFP prodotto circa 60.000 protoplasti (misurata in emocitometro). 2,6% di 65.000 eventi FACS-trattati sono stati definiti come GFP-positive e sono stati ordinati (Fig. 4b).

Otto lastre di circa 1.500 di quattro giorni di età P _WOX5:: piantine GFP ogni (12.000 in totale) fruttò circa 30.000.000 protoplasti (misurata in emocitometro). 0,063% di 16.000.000 eventi FACS-trattati sono stati definiti come GFP-positive e sono state ordinate (Figura 4c).

10.000 eventi ordinati sono tipicamente utilizzati per l'estrazione di RNA e può produrre 20-140 ng di RNA totale (Figura 5).

Figura 1. Cellula tipo-specifici linee GFP marcatore nella radice di Arabidopsis. Immagini di microscopia a fluorescenza sono state prese con un contrasto di interferenza differenziale (DIC) e un GFP filtro su un microscopio Eclipse 90i (Nikon) in esecuzione su software Metamorph (Molecular Devices). Le immagini DIC e GFP sono stati sovrapposti per fini di visualizzazione. Le due linee marker usato in questo esperimento visivo vengono mostrati;a) P _SCR:: GFP e b) P _WOX5:: GFP.

Figura 2. Semenzali impianto condizioni di crescita. Sono state coltivate in un controller ambientale idroponica in phytatrays (a) o su piastre di agar in posizione verticale (b).

Figura 3. Protoplasti vegetali che esprimono GFP. Immagini di microscopia a fluorescenza sono state prese con un contrasto di interferenza differenziale (DIC) e un filtro GFP un microscopio Eclipse 90i (Nikon) in esecuzione su software Metamorph (Molecular Devices). Le immagini DIC e GFP sono stati sovrapposti per fini di visualizzazione. Le frecce indicano una cella scoppio, detriti cellulari e un GFP-positive protoplasti. La distanza tra due linee bianche è di 50 micron.

Figura 4. Fluorescenza separazione delle cellule attivate del GFP-positive protoplasti protoplasti derivato da wild-type (a) P _SCR:.: GFP (b) o P _WOX5:: GFP (c) le linee marcatori sono stati analizzati e ordinati con un FACSAria (BD) utilizzando porte definito su un dotplot di verde (530/30 nm; asse x) rispetto rossa (610 / 20 nm; asse y) fluorescenza. 100.000 eventi sono presentati in ogni trama. Gli eventi che rientrano nel cancello ordinamento GFP sono evidenziati in verde.

Figura 5. Rappresentante estrazioni di RNA da 10.000 cellule ordinati. Cellule sono state ordinate direttamente in RNA tampone di estrazione (QIAGEN), l'RNA è stato purificato e controllato per la concentrazione, la purezza e l'integrità su un 2100 Bioanalyzer (Agilent). Tre repliche per entrambe le linee marker sono mostrati.

Discussione

Protoplasti può, in linea di principio, derivato da una varietà di tessuti vegetali, ottimizzando le condizioni favorevoli permetterà di migliorare notevolmente la qualità e la quantità di RNA. Sia la soluzione protoplasting e il buffer di incubazione elettiva utilizzati influenzano questo aspetto.

Molte diverse proteine ​​fluorescenti possono essere utilizzati, a seconda delle capacità del FACS utilizzato, ad esempio, GFP, RFP, YFP, CFP o le loro varianti e derivati. L...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 μm nylon mesh	Sefar Filtration	NITEX 03-250/50
100 μm nylon mesh	Sefar Filtration	NITEX 03-100/47
Square petri dishes	Fisher Scientific	08-757-10k
Phytatrays	Sigma-Aldrich	P1552
Murashige and Skoog Basal Medium (MS)	Sigma-Aldrich	M5519
sucrose	Fisher Scientific	S5-3
MES	Sigma-Aldrich	M2933
KOH	Sigma-Aldrich	P1767	10 M stock
Eclipse 90i microscope	Nikon Instruments
Cellulase R-10	Yakult Pharmaceutical
Macerozyme R-10	Yakult Pharmaceutical
D-mannitol	Sigma-Aldrich	M9546
KCl	Sigma-Aldrich	P8041	1 M stock
BSA	Sigma-Aldrich	A3912
β-mercapt–thanol	Calbiochem	444203
CaCl2	Sigma-Aldrich	C2536	1 M stock
orbital shaker	Labline Instruments
40 μm cell strainer	BD Biosciences	352340
conical 15 ml tubes	BD Biosciences	352196
table centrifuge	Sorvall, Thermo Scientific	Legend RT
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
FACSAria	BD Biosciences
1.5 ml microfuge tubes	VWR international	20170-38
RNeasy micro kit	Qiagen	74004
WT-Ovation Pico RNA Amplification System	NuGEN	3300_12
FL-Ovation cDNA Biotin Module V2	NuGEN	4200_12