Unicellulari registrazioni di aspirazione da Fotorecettori Cone mouse

Riepilogo

Mostreremo come registrare le risposte flash da coni del mouse utilizzando un elettrodo di aspirazione.

Abstract

Bastoncelli e coni della retina sono responsabili per la rilevazione della luce. Nel buio, nucleotidi ciclici-dipendenti (CNG) canali nel segmento esterno sono aperte e permettono il flusso di cationi costantemente verso l'interno attraverso la membrana, la cellula depolarizzanti. Esposizione alla luce provoca la chiusura dei canali CNG, blocca il flusso di corrente verso l'interno zione e, quindi, si traduce in iperpolarizzazione delle cellule. Sulla base della polarità di fotorecettori, un metodo di registrazione di aspirazione è stato sviluppato nel 1970 che, a differenza del classico patch-clamp, non necessita di penetrare la membrana plasmatica

Protocollo

Fare elettrodi

1. Rendere gli elettrodi di registrazione con un estrattore micropipetta e lucidare gli elettrodi con filamento di riscaldamento sotto il microscopio. Per la registrazione cono di aspirazione del mouse singola cellula, il diametro interno sulla punta dell'elettrodo è di circa 6-7 micron.
2. Preparare elettrodi di riferimento. Pesare 1% agar-agar in acqua distillata. Sciogliete la soluzione agar in bagno d'acqua calda. Riempire le pipette di vetro (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) con l'1% agar con siringa. Solidificare l'agar a temperatura ambiente per 10 minuti.
3. Tagliare le pipette a metà con un coltello di diamante.
4. Immergere gli elettrodi di riferimento nella soluzione di riferimento per almeno 24 ore a 4 ° C.

Di iniziare l'esperimento

5. Scuro adattare un topo in una gabbia nera durante la notte.
6. La preparazione di 100 ml soluzione di riferimento e soluzione 1 perfusione L (vedi sotto) e filtrare la soluzione.
7. Sciogliere 0,1% BSA e 10 mM glucosio in 20 mL di soluzione di riferimento.
8. Calibrare l'intensità della luce dello stimolatore ottico con fotometro.
9. Montare la camera di registrazione sul palco del microscopio invertito.
10. Bolla la soluzione di perfusione con il 95% O ₂ / 5% di CO _2, incubare a 40 ° C acqua del bagno per aumentare la solubilità di CO _2. La soluzione fluisce dalla bottiglia alla camera di registrazione passa attraverso una resistenza ceramica riscaldamento a 36-38 ° C. Il riscaldatore deve essere posizionato più vicino alla camera di registrazione possibile, idealmente nella fase del microscopio.
11. Regolare il regolatore di flusso per una portata di circa 1-1,5 ml / min.
12. Riempire l'elettrodo di registrazione con la soluzione di riferimento. Inserire l'elettrodo in una porta elettrodo. Assicurarsi che non vi siano bolle in dell'elettrodo. Montare il supporto sulla headstage dell'amplificatore. Collegare il titolare di un dispositivo di aspirazione, che è costruito da collegamento di tubi parzialmente riempito con olio minerale al side-port del titolare elettrodo. L'altra estremità del tubo è collegato ad un piccolo serbatoio di olio minerale, a cui la pressione può essere applicata per via orale.
13. Collegare l'elettrodo di riferimento per l'altro polo del headstage. Associare la coppia termica (TC) per l'elettrodo di riferimento. Assicurarsi che le punte degli elettrodi e TC sono vicini tra loro in modo che la lettura della temperatura è presa il più vicino alla cella possibile.
14. Accendere l'illuminazione a infrarossi per visualizzare l'elettrodo. L'elettrodo è vista da telecamera a infrarossi collegata a un monitor. Centrare l'immagine elettrodo sul campo visivo e del monitor utilizzando un micro-manipolatore.
15. Regolare la posizione della punta stretta elettrodo di riferimento (2-4 mm) per l'elettrodo di registrazione.
16. Regolare la tensione continua per il riscaldamento in modo che la temperatura della soluzione è di circa 36-38 ° C.
17. Eseguire un test di tenuta per verificare la resistenza di elettrodo di registrazione, di solito circa 900 kΩ.

Isolare la retina del mouse

18. Sotto fioca luce rossa, eutanasia il mouse adattato all'oscurità con CO ₂ e dislocazione cervicale. Segna i bulbi oculari usando la punta di una torcia metallo caldo da cauterizzare il punto più dorsale della sclera leggermente. Enucleare i bulbi oculari con le forbici. Tutte le procedure successive sono eseguite sotto la luce a infrarossi.
19. Hemisect i bulbi oculari sotto microscopio con illuminazione a infrarossi e convertitori di immagini.
20. Togliere la cornea e la lente. Rimuovere la maggior quantità di vitreo possibile.
21. Per registrare M-cono risposte, rimuovere la parte ventrale della conchiglia oculare ⁴ con una lametta a giudicare dal punto cauterizzazione.
22. Sbucciare la retina dallo strato dell'epitelio pigmentato.
23. Appiattire la retina e posizionarlo sul fondo della scatola di Petri riempite con 1-2 mL di soluzione di riferimento.
24. Tagliate la retina in piccoli pezzi sottili con una lametta e incubare la preparazione in una scatola a tenuta di luce satura di ossigeno puro.

Registrazioni

25. Spegnere il riscaldatore temporaneamente. Accendere il flusso di perfusione ad una tubazione di bypass per evitare che la camera di essiccazione.
26. Scolate la maggior parte della soluzione nella camera con un pezzo di tessuto Kimwipe. Trasferire la sospensione retina alla camera di registrazione usando una pipetta di vetro.
27. Attendere circa 2 minuti fino a quando le fette retina stabilirsi. Accendere la perfusione indietro. Accendere il riscaldamento.
28. Accendere l'illuminazione a infrarossi per visualizzare la preparazione. Ricerca di un pezzo di retina sdraiato sul da camera con segmenti esterni dei fotorecettori sporgenti (vedi figura esempio). Disegnare i segmenti interni dolcemente verso l'elettrodo di aspirazione. In questa configurazione, i nuclei numerosi e segmenti interni deve essere aspirato nella dell'elettrodo. Registrare il fotorisposta di un lampo luminoso per verificare se un segmento di cono interno è l'elettrodo e se la cella è guariretua, a giudicare dalla risposta cinetica e ampiezza.
29. Abbassare il serbatoio minerale di applicare una leggera pressione negativa per la punta di un elettrodo per contribuire a tenere il segmento interno nella elettrodo.
30. Record di prova-flash risposte dim all'intensità luminosa una volta una cella buona è stata trovata. Lampi di prova sono forniti da un calibrato stimolatore ottico ^5. L'intensità del flash e lunghezza d'onda sono controllati da una serie di filtri a densità neutra e filtri di interferenza a banda stretta, rispettivamente. Test di durata del flash (20 ms) è controllato da computer-guidata persiane.

Soluzioni

1. Topo soluzione perfusione: 112,5 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2,4 mM MgCl _2, 1.2 mM CaCl _2, 10 HEPES mM (pH 7,4), 20 mM NaHCO _{3, 3} mM Na succinato, 0,5 mM Na glutammato, 0.02 mM EDTA, e 10 mM glucosio.
2. Topo elettrodo soluzione di registrazione: 140 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2,4 mM MgCl _2, 1.2 mM CaCl _2, 3 HEPES mM (pH 7,4), 0,02 mM EDTA.

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Discussione

Cella singola registrazione di aspirazione da fotorecettori è stato sviluppato 3 decenni fa. Essa ci permette di registrare trans-membrana variazione di corrente indotta dalla stimolazione luminosa senza penetrare la membrana cellulare. A causa della elevata adesione cellula-cellula, è difficile isolare sano singola asta e il cono di retina del mouse come retina anfibi ed è difficile trovare coni singoli a causa della bassa percentuale (3%) e piccole dimensioni. L'interno-in-segmento (IS-in) metodo di registrazio...

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