Realizzazione e di funzionamento di un Inserto di ossigeno per colture cellulari aderenti

Riepilogo

Realizzazione e validazione di un add-on piattaforma che offre un controllo maggiore sulla ossigenazione spaziale e temporale in un 6-pozzetti. Il dispositivo è adattabile a una serie di sistemi di coltura e può essere utilizzato per studiare gli effetti di ossigeno sulla guarigione delle ferite.

Abstract

L'ossigeno è un modulatore chiave di molte vie cellulari, ma i dispositivi di corrente permettendo

Protocollo

1. Dispositivo di funzione

1. Il dispositivo inserire ipossiche contiene 6 montanti che nidificano in uno standard a 6 pozzetti. Gas fluisce nel pilastro, attraverso una rete microfluidica alla base del pilastro, e rifluisce dal dispositivo. Alla base del pilastro che formano la parete di fondo della microcanali è di 100 micron di spessore gas-permeabile membrana PDMS che permette la diffusione di ossigeno tra il gas microcanali e dei media della cultura. Così, il dispositivo funziona creando un gradiente di concentrazione che spinge la concentrazione di ossigeno dei media verso un valore desiderato.
2. Il dispositivo offre una serie di vantaggi rispetto alla camera di ipossia e altri sistemi di ossigenazione delle cellule: 1) riduce al minimo il percorso di diffusione di ossigeno permettendo il controllo più veloce temporale, 2) migliora il controllo dello spazio sopra l'ossigenazione, in quanto dipendente dalla progettazione pilastro microcanali, 3) possiede un impronta di laboratorio più piccolo e un throughput più elevato per aumentare l'efficienza sperimentale, e 4) si adatta a strumenti comuni di coltura cellulare (per esempio piastra pozzetti) senza la necessità di conoscenze specialistiche e delle attrezzature.

2. Dispositivo di fabbricazione

1. Primo pilastro è l'array replica stampato con PDMS in uno stampo precedentemente lavorato Delran.
2. Avanti il ​​gas microcanali in fondo a ogni pilastro è fabbricato utilizzando le normali SU-8 fotolitografia e PDMS stampaggio replica.
3. Il gas-permeabile membrana è fabbricato facendo girare definito di PDMS su un wafer di silicio per ottenere lo spessore desiderato. In questo esempio si usa un 100 micron di spessore della membrana, che è stato fabbricato dal giro 500 giri per 10 secondi e 900 giri per 30 secondi.
4. Tutti i componenti sono legati tra loro dopo il trattamento al plasma di ossigeno con un dispositivo portatile al plasma (modello BD-20, Electro-Technic Prodotti).

3. Dispositivo di setup

1. Inserire delicatamente dispositivo nel piatto, avendo cura di evitare bolle. L'inclinazione del dispositivo durante l'inserimento aiuta ad espellere le bolle fuori un lato. Per gli effettivi a base di cellule esperimenti, questo passaggio deve essere fatto all'interno di una cappa sterile a flusso laminare. Le possibilità di contaminazione sono notevolmente ridotti una volta che il dispositivo è inserito, in modo che il montaggio può essere effettuato verso l'incubatore in un ambiente non sterile.
2. Collegare il tubo dal serbatoio di gas di origine alla porte di ingresso e uscita del dispositivo. Per i cellulari basati su esperimenti, l'incubatore cultura dovrebbe avere un buco di permesso di ingresso tubo e il tubo deve essere collegato dopo aver portato il dispositivo e metterlo nella incubatrice. Fare attenzione a non mettere pressione eccessiva sul dispositivo, che potrebbe deformare il PDMS sufficiente per schiacciare le cellule sottostanti.
3. Assicurarsi che il regolatore di flusso di precisione sia chiuso prima di aprire il regolatore canotta per evitare di eccedere il dispositivo. Avviare il flusso del gas. Aprire delicatamente il flusso regolatore di precisione a portata desiderata (50-100 ml / min). Guarda il valore strettamente nell'ora successiva ed effettuare le modifiche necessarie, dal momento che la caduta di pressione cambierà mentre il sistema equilibra, alterando la portata. Per evitare la formazione di bolle nei media, ridurre la portata di tra 10-20 ml / min, dopo un iniziale equilibrio durata di 15 minuti con la portata più alta.
4. Dopo aver desiderato la durata sperimentale, arrestare la fuoriuscita del gas, togliere il piatto, e le cellule di conseguenza processo (ad esempio lisare, macchia, conteggio, ecc.)

4. Dispositivo di convalida

1. Calibratura
   1. Selezionare il numero e la localizzazione delle posizioni sul ossigeno fluorescente
      (FOXY) scivolo sensore (a seconda delle esigenze di validazione) che verrà utilizzato per la misurazione dell'ossigeno. La diapositiva contiene un colorante fluorescente rivestimento rutenio che si spegne da ossigeno.
   2. Esporre scivolare direttamente a 0, 10, e 21% di ossigeno dal serbatoio di gas e di catturare immagini dopo 5 minuti di equilibrio corretto.
   3. Esportare l'intensità media dell'immagine per ogni posizione e l'ossigenazione concentrazione trama come dipendente intensità fluorescente.
   4. Generare la curva di calibrazione inserendo curve lineari alla linea 0-10% e 10-21% di linea.
2. Eterogeneità
   1. Stabilire più punti si estende la larghezza del canale a un intervallo definito (ad esempio ogni 1 mm). Si noti che ci possono essere sovrapposizione di immagini a seconda della distanza.
   2. Misurare la concentrazione di ossigeno in superficie e attraverso il dispositivo
3. Equilibrazione
   1. Scegliere tre punti sul vetrino FOXY in cui misurare la concentrazione di ossigeno.
   2. Immediatamente dopo la cattura una prima immagine a livelli di ossigeno ambiente, aprire il regolatore di flusso di precisione per iniziare il flusso di gas nel dispositivo. Catturare immagini ad un intervallo appropriato per valutare la durata e la portata di Concentrazione di ossigenozione di equilibrio (ad esempio ogni 10 secondi per 30 minuti).

5. Applicazioni

1. Wound Healing
   1. Un giorno prima dell'esperimento, immergere l'inserto sterilizzati PDMS in mezzo privo di siero per ridurre il inibire la formazione di bolle di gas nel pozzo.
   2. Cellule cultura al 100% confluenza in un 6-pozzetti.
   3. Crea graffi dritto negli monostrati con una punta P200 pipetta per simulare ferite.
   4. Aspirare i mezzi di comunicazione cellulare, lavare con 5 ml di mezzi, e aspirare di nuovo. E 'importante non disturbare il monostrato di cellule.
   5. Riempire i pozzetti con 4 mL mezzo privo di siero per ridurre la proliferazione cellulare.
   6. Inserire luogo nei pozzetti e collegare ogni bene a una concentrazione di ossigeno corrispondente.
   7. Posto a 6 pozzetti con inserto sul palco riscaldato a 37 ° C.
   8. Catturare immagini lasso di tempo le cellule all'intervallo desiderato e la durata totale. T_Scratch di MATLAB, un algoritmo di misurazione ferita, può essere utilizzato per analizzare l'area non cicatrizzate di superficie.

6. Rappresentante Risultati

1. Dispositivo di convalida
   Il dispositivo inserire ipossia mostra grandi miglioramenti sopra la camera ipossica in termini di tempo ossigeno equilibrio e misura, che richiede meno di 2 minuti a stabilizzarsi al 0,5% di ossigeno. La membrana-e dispositivo di dimensioni divario fondo è stato il fattore critico nel determinare l'efficienza equilibrio, con dimensioni gap più grandi che richiedono più tempo per arrivare allo stato stazionario valori di concentrazione di ossigeno. Il dispositivo permette anche una grande quantità di controllo sulla ossigenazione spaziali in un singolo pozzo, permettendo la formazione di più condizioni, e persino generare un profilo ciclico ossigeno sulla superficie del pozzo.
2. Guarigione delle ferite
   Monostrati cellulari sono stati esposti a 10% o 21% di ossigeno e la superficie della ferita è stato analizzato nel corso del tempo. Graffi esposte al 21% di ossigeno chiuso il più lento e il 10% più veloce. La figura 1 mostra le immagini di un graffio nel corso di 17 ore. I grafici in Figura 5 mostrano la percentuale di superficie ferita aperta per entrambe le concentrazioni di ossigeno per tutta la durata dell'esperimento.

Figura 1. Schematica e diagrammi che illustrano le funzioni del dispositivo. Il dispositivo inserire ossigeno è fabbricata fotolitografia convenzionale (rete microfluidica), stampaggio replica (microfluidica rete e inserire scaffold), e definito filatura di PDMS (gas-permeabile membrana). A) Il dispositivo ossigeno annidato in un 6-pozzetti. B) Esempi di 24 e 96 ben array pilastro. C) Una sezione trasversale schematica di un pilastro. Flussi di ossigeno nel dispositivo attraverso l'ingresso e viaggia attraverso una rete microfluidica sul fondo del pilastro. L'ossigeno può diffondere liberamente attraverso la membrana permeabile al gas PDMS in fondo alla colonna e si dissolvono in terreni di coltura. D) Un immagine al microscopio che mostra le varie caratteristiche di un singolo canale pilastro dall'alto, con i messaggi di vetro incollato per gli studi equilibrio.

Figura 2. Convalida del dispositivo con sensori di ossigeno. Tensione di ossigeno all'interno di ogni bene è stato caratterizzato utilizzando un sensore di ossigeno planare rutenio. Tutte le miscele di ossigeno contenuto equilibrato di azoto e del 5% di CO ₂ per il buffering dei media. A) Plot che illustra l'effetto di altezza posta, e la distanza di diffusione dell'ossigeno in tal modo tra la membrana e le cellule, il tempo di equilibrio ed efficacia. Altezze sono stati stabiliti dal vetro intagliato i messaggi legati alla parte inferiore del dispositivo. Tutte le dimensioni triennale post resa equilibrio tempi molto migliorata nel corso della camera di ipossia. Si noti che il tempo è su una scala logaritmica. B) Plot raffigurante il rapido tempo di equilibrio di ossigeno di risposta del dispositivo 0,2 millimetri gap. C) multi-posizione linescans sono state prese in tutto il bene sotto la microcanali per assicurare l'omogeneità della concentrazione di ossigeno introdotta dal dispositivo. Il grafico mostra la concentrazione di ossigeno misurata dopo infusione di 0%, 10% e 21% di ossigeno per 10 minuti. D) del dispositivo mantiene efficacemente il 10% di ossigeno in 5 giorni.

Figura 3. Sperimentazione con i disegni più complessi ossigeno microcanali. A) di configurazione Dual-microcanali produce una condizione stabile dello 0% e il profilo di ossigeno del 21% oltre 14 giorni. B) Un modello interdigitati e tortuose di microcanali micron di larghezza max 500 ° si estende attraversorisultati pilastro e in un profilo ciclico ossigeno. Si noti che i dati rappresenta solo uno studio di rappresentanza come l'allineamento a microcanali è stata difficile.

Figura 4. Immagini Timelapse di chiusura della ferita 0, 7, e 17 ore dopo zero iniziale. Le cellule sono state consegnate 21% di ossigeno per tutta la durata dell'esperimento.

Figura 5. Effetto della concentrazione di ossigeno sul tasso di guarigione delle ferite in un test di zero.

Discussione

Il dispositivo è fabbricato dalla norma SU-8 fotolitografia, stampaggio replica, e definito filatura e fatto interamente di polidimetilsilossano. Il gas è introdotto nel dispositivo di stabilire un gradiente di concentrazione tra il pilastro microcanali e terreni di coltura, guida il sistema verso una concentrazione di ossigeno equilibrio desiderato. Il dispositivo ha dimostrato di modulare efficacemente l'ossigenazione temporale e spaziale all'interno di un pozzo, così come modulare il comportamento cellulare in modo appropriato. Il modello spaziale di ossigenazione è definito dal microcanali alla base del pilastro, così una varietà di disegni potrebbero essere attuate nella realizzazione dei fotomaschera. Inoltre, l'infusione del gas desiderato nella fase gassosa del pozzo dovrebbe migliorare il tempo di equilibrio e misura di ipossia. Una rete microfluidica miscelazione potrebbe essere adattato al dispositivo per fornire un mezzo per la produzione di miscele di gas romanzo da solo un paio di serbatoi di gas magazzino. Infine, un meccanismo per lo scambio dei media eliminerebbe la necessità per la rimozione del dispositivo dal piatto pozzetti, di cui le cellule possono rispondere.

Il dispositivo ha le applicazioni in qualsiasi esperimento in vitro o ex vivo che richiedono il controllo della concentrazione di ossigeno. Come l'ossigeno è una variabile importante fisiologica interessano una vasta maggioranza di vie di segnalazione, le aree di ricerca che potrebbero trarre beneficio è limitato dalla creatività del ricercatore. Alcuni campi che potrebbero trarre beneficio dalla maggiore controllo temporale della concentrazione di ossigeno sono metastasi del cancro, apnea del sonno, e danno da riperfusione ischemia cardiaca, tra molti altri. Per esempio, l'ipossia intermittente è stata correlata con i tumori più invasivi, upregulating metastastis un certo numero di geni associati alla relativa ipossia continuo e normossia. Controllo spaziale è anche importante, come gradienti di ossigeno sono essenziali per lo sviluppo, zonazione fegato, tossicità da farmaci, e la nicchia delle cellule staminali. Il dispositivo presentato in questo articolo beneficeranno un certo numero di aree di ricerca, fornendo un sistema con un ingombro più piccolo laboratorio, le esigenze operative relativamente semplice, e il controllo di gran lunga maggiore sovraesposizione ossigeno alle cellule.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS-Sylgard 184	Dow Corning
Planar FOXY sensor	Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator	Omega Engineering, Inc.	FL-1472-G
Gas	Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150	MicroChem Corp.
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine	SAFC Global	M3803
Fetal Bovine Serum	ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513