Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

Riepilogo

La quantificazione di DNA a doppio filamento striature formazione γH2AX utilizzando come marcatore molecolare è diventata uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui mostriamo l'utilizzo di un test di immunofluorescenza per la quantificazione della γH2AX focolai dopo l'esposizione delle cellule alle radiazioni.

Abstract

DNA a doppio filamento (DSB), che sono indotti da processi metabolici sia endogena o da fonti esogene, sono una delle lesioni del DNA più critici in termini di sopravvivenza e la conservazione dell'integrità del genoma. Una risposta presto per l'induzione di DSB è la fosforilazione della variante dell'istone H2A, H2AX, alla serina-139 residui, altamente conservati nel C-terminale motivo SQEY, formando γH2AX

Protocollo

Preparazione delle cellule

1. Cheratinociti umani (FEP-1811) sono state coltivate in cheratinociti-siero Media gratuito (K-SFM; Invitrogen) integrato con il fattore di crescita epidermico, estratto di ipofisi bovina e 20 mg / ml di gentamicina, a 37 ° C e 5% di CO _2.
2. Una sospensione singola cella è stata preparata da staccare con tripsina-EDTA (0,05% v / v)
3. Le cellule sono state seminate a 8-Tek ben Lab II diapositive microchamber (10.000 cellule / pozzetto) e le diapositive sono state incubate per 3 giorni a 37 ° C e 5% di CO _2.

Irradiazione

1. Le cellule sono state irradiate su ghiaccio con 2 Gy utilizzando una sorgente di ¹³⁷ Cs (Gammacell 1000 Elite irradiatore; Nordion internazionale, ON, Canada, 20,6 secondi / Gy)
2. Controllo irradiato e 2 Gy cellule irradiate sono state incubate per 1 ora a 37 ° C e 5% di CO _2.

Immunofluorescenza

1. Media è stata una soffiata e le cellule sono state lavate con 300μl di PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +)} per bene e sono stati ruotati su un mixer orbitale per 5 minuti.
2. Il buffer è stata una soffiata e 100μl di preparati al momento 4% (v / v) è stato aggiunto paraformaldeide in ciascun pozzetto e diapositive sono state incubate a temperatura ambiente per 10 minuti.
   Tutte le incubazioni sono state eseguite in una vasca colorazione umidificata
3. Le cellule sono state poi lavate con PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +).} I vetrini sono stati posti in una vaschetta Coplin e ruotata su un mixer orbitale per 5 minuti. Questa fase di lavaggio è stata ripetuta altre due volte.
4. Il buffer è stata una soffiata e l'eccesso di PBS è stato gentilmente cancellato.
5. Le cellule sono state permeabilizzate con 100ml Triton X-100 (0,1% v / v) per bene e una incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente.
6. Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +),} come descritto nei punti 3 e 4 di cui sopra.
7. Non specifico legame con le proteine ​​è stato bloccato con 100 ml di BSA (1% v / v) per bene e 20 minuti di incubazione a temperatura ambiente.
8. L'eccesso di BSA è stata una soffiata e 100μl di mouse primario monoclonale anti-fosfo-istone H2AX anticorpi (diluito 1:500 in 1% BSA, Millipore), è stato aggiunto in ciascun pozzetto di una incubazione 1 ora a temperatura ambiente.
9. Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +),} come descritto nei punti 3 e 4 di cui sopra e incubato con 100μl di anticorpo secondario (Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di topo diluito 1:500 in BSA 1% ; Invitrogen) per bene per 45 minuti a temperatura ambiente al buio. (Anticorpo diluito è stato tenuto all'oscuro durante tutta la procedura)
10. Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +),} come descritto nei punti 3 e 4 di cui sopra. Tuttavia, l'esposizione alla luce è stato minimizzato usando pellicola.
11. Di contrasto nucleare è stata eseguita con 100ml TOPRO3 (diluito 1:500; Invitrogen) per bene e una incubazione 10 minuti a temperatura ambiente
12. Le cellule sono state lavate con PBS (w / o Ca ^{2 +} o Mg ^{2 +)} come descritto al punto 10.
13. Le camere sono state accuratamente rimosse dalle guide di scorrimento, l'umidità in eccesso è stato cancellato e le diapositive sono stati lasciati asciugare all'aria.
14. Una goccia di prolungare ORO anti-sbiadimento soluzione (Invitrogen) è stato aggiunto per bene e le diapositive sono state montate (22x50 millimetri coprioggetto) e il liquido in eccesso lungo i bordi di scorrimento è stata cancellata.
15. I vetrini sono stati tenuti al buio per altri 30 minuti a temperatura ambiente prima di sigillare con smalto.
16. I vetrini sono stati conservati durante la notte a 4 ° C al buio prima dell'analisi.

Microscopia / Analisi

1. Meta confocale Zeiss LSM510 Microscpe utilizzato per acquisire immagini utilizzando la GFP standard (per γH2AX - Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG) e laser rosso lontano (per TOPRO-3). Tipicamente, un olio 63 x lente ad immersione obiettivo è utilizzato.
   Le immagini sono acquisite in una serie Z tracciato con dimensione del passo di 0,5 micron. Un passo di 0,5 micron è stata scelta per minimizzare la perdita di focolai presenti nei diversi piani nei nuclei. Durante l'analisi, i piani individuali sono deconvoluted e sovrapposti per produrre una immagine proiettata al massimo per ridurre al minimo la sovrapposizione di focolai (Top-hat filtro applicato).
2. Metamorph (Molecular Devices, USA) è stato utilizzato per analizzare il numero di focolai.
   Il programma quantitates il numero di focolai in ogni cella dopo la soglia è stata applicata per escludere sfondo. Le informazioni vengono registrate in un foglio di calcolo Microsoft Excel per ulteriori analisi.

Figura 1. Visualizzazione di immunofluorescenza γH2AX focolai (verde) non trattati in cheratinociti umani e in cellule irradiate con 2 Gy e incubate per circa 1 ora a 37 ° C, 5% di CO _2. Il DNA è stato macchiato con TOPRO-3 (blu). Immagini sono state acquisite utilizzando un Zeiss LSM 510 Meta microscopio confocale. Bar = 10 micron.

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Figura 2. Visualizzazione di immunofluorescenza γH2AX focolai (verde) in cheratinociti umani e in cellule irradiate con 2 Gy e incubate per circa 1 ora a 37 ° C, 5% di CO _2. Immagini sono state acquisite utilizzando un Zeiss LSM 510 Meta microscopio confocale utilizzando 0,5 micron Z-sezionamento (1-9) per garantire che tutti focolai sono stati acquisiti. Le immagini è stata poi impilati per la quantificazione utilizzando Metamorph. Il DNA è stato macchiato con TOPRO-3 (blu). Il γH2AX impilati e le immagini blu erano accatastati per la visualizzazione. Bar = 10 micron.

Discussione

In seguito all'esposizione a radiazioni ionizzanti (raggi γ), γH2AX forma foci rapidamente e numeri focolai raggiungono un massimo tra 30-60 minuti ^2. Pertanto, il nostro 1 ora dalla irradiazione punto di tempo riflette la formazione iniziale DSB. Abbiamo usato la dose di radiazioni clinicamente rilevante di 2 Gy per il nostro esperimento. Tuttavia, il metodo può essere utilizzato per dosi di radiazioni fino a 4 Gy per il rilevamento di formazione iniziale DSB; sovrapposizione significativa di focolai ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM)	Media	Invitrogen	17005042	Keratinocyte media supplemented with human recombinant Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53), and Bovine Pituitary Extract (BPE).
Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)	Chamber Slides	Nalge Nunc international	NUN154534
Coverslips (22x50mm)	Coverslips	Menzel-Glaser	CS2250100
Bovine Serum Albumin (BSA)		Sigma-Aldrich	A7906	BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.
PBS (without Ca2+ and Mg2+)		Invitrogen	17-517Q
0.5% Trypsin-EDTA x10		Invitrogen	15400-054	Trypsin-EDTA (0.05%) used to detach cells from culture flasks.
Triton X-100	Reagent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.
Paraformaldehyde	Reagent	Sigma-Aldrich	158127	Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody	Primary Antibody	EMD Millipore	16193	Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Secondary Antibody	Invitrogen	11029	Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.
TOPRO3	DNA Stain	Invitrogen	T3605	DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser.
ProLong Gold	Anti-fade solution	Invitrogen	P36930	Refractive index of 1.42 at 20°C.
Tissue Culture Flask, Vented Cap	Culture Flask	BD Biosciences	353112
Tissue Culture Dish (150x25mm)	Petridish	BD Biosciences	353025
Coplin Jar, glass		Grale Scientific P/L	1771-OG
Staining Trough		Grale Scientific P/L	V1991.99
Gammacell 1000 Elite Irradiator	Gamma Irradiator	Nordion International Inc.
Zeiss LSM 510 Meta Confocal	Confocal Microscope
Metamorph	Software for Imaging analysis	Molecular Devices