Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Riepilogo

Abstract

Protocollo

La reazione della trascrittasi inversa

Girare blocco riscaldamento a 70-80 ° C e 42 ° C. Bagni di acqua può essere utilizzata anche in questo passaggio. Se si utilizza blocchi di riscaldamento, mettere un po 'd'acqua in modo che il calore è uniforme.

1. Adescamento di reazione
   1. Prendete 3 g di RNA
   2. Regolare il volume a 13 microlitri con acqua RNasi libero
   3. Aggiungere 2,5 ml di casuale esamero primer (2mg/ml)
2. Mescolare bene e incubare a 70-80 ° C per 8 minuti. Poi, posto in ghiaccio per 5 min.
3. RT preparare cocktail (14,5 microlitri / RXN):
   
   

   Componente	Volume
   5X tampone prima parte	6 microlitri
   0,1 M DTT	3 ml
   25X aminoallyl-dNTP mix	1,2 microlitri
   SuperScript II RT (200U/μl)	2,3 microlitri
   Acqua	2,0 microlitri

   
   * Fra le reazioni n, preparare Master Mix per n 0,5 aliquote di cocktail per assicurare che non si esaurirà.
   
   
4. Aggiungi 14,5 microlitri a reazioni raffreddato.
5. Mix (non vortex) e incubare a 42 ° C per 3-4 ore
6. I campioni possono essere conservati a -20 ° C se necessario.

Idrolizzare l'RNA

1. Per ogni campione, aggiungere 3 ml di NaOH 1 N e 0,6 l di 0,5 M EDTA. (Final conc.s = 100mM NaOH, 10mM EDTA)
2. Miscelare e incubare a 65 ° C per 10 minuti.
3. Neutralizzare con l'aggiunta di 33,6 microlitri HEPES 1M, pH = 7.0 (finale conc .= 500mm HEPES)
4. I campioni possono essere conservati a -20 ° C, se necessario.

Reazione di purificazione: la rimozione di personalità giuridica aa-dUTP e ammine libero

Nota: Questo protocollo di purificazione è modificata rispetto alla PCRpurification Qiagen QIAquick protocollo kit. Il lavaggio del fosfato e buffer di eluizione sono sostituiti i buffer Qiagen fornito perché i buffer Qiagen contengono ammine gratuito che competere con la reazione di accoppiamento Cy colorante. Le colonne dalla mini-prep kit può anche essere usato.

1. Miscela di reazione cDNA con 300 ml (o il volume di reazione 5X = 336 mL) di buffer PB (Qiagen in dotazione) e trasferimento alla colonna QIAquick.
2. Porre la colonna in un tubo di raccolta da 2 ml (Qiagen in dotazione) e centrifugare a ~ 13.000 rpm per 1 minuto. Raccolta tubo vuoto.
3. Per lavare, aggiungere 750 microlitri di tampone di lavaggio fosfato (non è Qiagen) alla colonna e centrifugare a ~ 13.000 rpm per 1 minuto.
4. Svuotare il tubo di raccolta e ripetere il lavaggio 750 microlitri e fase di centrifugazione.
5. Svuotare il tubo di raccolta e centrifugare la colonna un ulteriore 1 minuto a velocità massima.
6. Trasferimento colonna in una nuova provetta da microcentrifuga 1,5 ml e con cautela, 30 microlitri di buffer di eluizione fosfato. (Vedi sezione preparazione soluzione)
7. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
8. Eluire per centrifugazione a ~ 13.000 rpm per 1 minuto.
9. Eluire una seconda volta (con un altro 30 microlitri di tampone fosfato eluizione) nel tubo stesso ripetendo i passaggi 6-8. Il volume di eluizione finale dovrebbe essere ~ 60 microlitri.
10. La quantità di cDNA può essere quantificata in questa fase:
    ng = cDNA (fattore di diluizione) (OD260) (37) (volume totale eluito dalla colonna)
11. Campione secco a una velocità di vac a 45 ° C.
12. I campioni possono essere conservati a -20 ° C se necessario.

Accoppiamento aa-cDNA a Cy Ester Dye

1. Risospendere aminoallyl cDNA marcato con 10 microlitri 50 mM Na-bicarbonato, pH = 9,0, se necessario. (Questo buffer dovrebbe essere preparata fresca ogni due settimane)
2. Lavorare in un luogo buio, aggiungere la sonda a un tubo del colorante Cy appropriato. Pipettare volte su e giù parecchie per sospendere di nuovo il colorante.
3. Incubare la reazione per 1 ora al buio a temperatura ambiente. (Incubazione può arrivare fino a due ore)

Reazione Purificazione II: la rimozione di colorante disaccoppiato

1. Per la reazione di aggiungere 35 microlitri NaOAc 100 mM pH 5.2. Mescolare accuratamente.
2. Aggiungere 250 microlitri (o il volume di reazione 5X = 225 mL) tampone PB (Qiagen in dotazione) per ogni campione e mescolare pipettando su e giù.
3. Inserire una colonna di spin QIAquick in un tubo di raccolta di 2 ml (Qiagen in dotazione), applicare il campione alla colonna e centrifugare a ~ 13.000 per 1 minuto. Raccolta tubo vuoto.
4. Per lavare, aggiungere 0,75 ml di tampone PE (Qiagen in dotazione) alla colonna e centrifugare a ~ 13.000 per 1 minuto.
5. Ripetere il punto 4.
6. Raccolta tubo vuoto e colonna centrifugare per un altro 1 minuto alla massima velocità.
7. Colonna Mettere in una provetta da microcentrifuga pulito 1,5 ml e con cautela, 30 microlitri tampone EB (Qiagen in dotazione) per il centro della membrana colonna.
8. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
9. Eluire per centrifugazione a ~ 13.000 rpm per 1 minuto.
10. Eluire una seconda volta nel tubo stesso ripetendoi passaggi 7-9. Il volume finale eluiti dovrebbe essere ~ 60 microlitri.

Analisi di reazione di marcatura

La quantità di cDNA e l'etichetta può essere quantificata in questa fase:

• Misura OD 260, 550 e 650 (Blank è l'acqua.) Utilizzare il programma NanoDrop microarray.
• Calcolare la pmol di costituzione coloranti e DNA e nuc pmol / colorante rapporto con le equazioni sotto riportato:
  
  nucleotidi pmol = [OD260 volume * (mL) * 37 ng / mL * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol

Nota: 1 OD260 = 37 ng / mL per cDNA; 324,5 pg / pmol peso molecolare medio di un dNTP)
pmol di Cy3 OD550 * = volume (mL) / 0.15
pmol Cy5 OD650 * = volume (mL) / 0.25
nucleotidi / rapporto colorante cDNA = pmol / pmol Cy colorante

Se si utilizza NanoDrop, dà già pmol / mL per ogni tinta. Hai solo bisogno di moltiplicare questo numero per volume di ottenere totale incorporazione pmol colorante.

Nota:> 150-200 pmol di costituzione colorante per campione e un rapporto di meno di 20 nucleotidi / molecole di colorante è ottimale per ibridazioni.

• Campioni possono essere conservati a -20 ° C al buio.
  • Combinano sonde di essere ibridato insieme e asciutto nel speedvac a 42 ° C.
  • I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino al momento di Ibr.

Pre-Hyb diapositive

1. Faccia scivolare verso il basso posto oltre RT 100 ml di acqua in un supporto pulito scivolo rosso per 3-5 minuti
2. Scatto secco la diapositiva mettendo a faccia in su di 100 ° C il riscaldamento blocco per alcuni secondi - guarda per la condensazione a sparire
3. UV cross-link la diapositiva a 250 mJoules (Inserisci il 2500 a reticolante UV)
4. Diapositive idrato per immersione in pre-riscaldato acqua 42 ° C. Spin 5 min a 700 giri a temperatura ambiente.
5. Diapositive incubare in vasetto da 50 ml contenente Coplin preriscaldata pre-Ibr (5XSSC, BSA 1%, 0,1% SDS) per almeno 45 minuti a 42 ° C, e l'incubazione può andare più a lungo se necessario.
   
   50 ml di pre-Hyb tampone: 12,5 mL 20x SSC, 10 ml 5% di BSA, 0,5 ml 10% SDS, 27 ml di acqua
   
   
6. Immergere i vetrini in pre-riscaldato acqua (42 ° C) e agitare un paio di minuti per eliminare pre-Hyb buffer.
7. Sciacquare in isopropanolo e spin 5 min a 700 rpm, temperatura ambiente, ad asciugare.

Preparazione dei campioni per l'ibridazione

1. Risospendere sonda in acqua (volume sono riportati di seguito)
   
   

   Per un totale vol. = 30μl	Per un totale vol. = 35μl	Vol .= per un totale di 40μl
   19,8 microlitri di acqua	23,55 di acqua microlitri	27,2 microlitri di acqua
   1,5 microlitri	1,5 microlitri	1,5 microlitri	10 mg / ml di DNA dello sperma di salmone (Invitrogen)
   1,2 microlitri	1,2 microlitri	1,2 microlitri	12,5 mg / ml tRNA
   4,5 microlitri	5,25 microlitri	6 microlitri	20XSSC (3X finale)
   3 ml	3,5 microlitri	4 microlitri	1% SDS

   
   Nota: L'ordine di aggiunta dei reagenti sono importanti. Non preparare master mix.
   
   
2. Far bollire per 5 minuti, poi girare 5 minuti a 14.000 giri al minuto. Raffreddare per 2 minuti a temperatura ambiente.

Ibridazione

1. Aggiungere 10-12 ml di SSC 3X per i pozzi della camera di ibridazione su ogni bordo e al centro.
2. Aggiungi una scivolata pulita sollevatore per l'area appropriata della diapositiva e delicatamente carico in soluzione di ibridazione (30 -40 microlitri). Ci dovrebbe essere campione aggiuntivo su entrambi i bordi del vetrino.
3. Mettere il vetrino nella camera. Serrare le viti e mettere in un bagno di acqua a 65 ° C durante la notte. Non posizionare la camera direttamente sul fondo della vasca d'acqua. Posizionare un blocco sulla parte superiore della camera superiore a tenere tutto a posto. Tenere il coperchio sul bagno in acqua per proteggere i campioni sensibile alla luce.

Ibr Lava

1. Preparare i buffer seguenti:
   • SSC 1X, 0,05% SDS
   • 0,06 X SSC
2. Dopo la camera di ibridazione dissigillare incubazione. Rimuovere il vetrino dalla camera, facendo attenzione a non disturbare il coprioggetto.
3. Per rimuovere coprioggetto, scivoli immergere in un piatto caldo contenente SSC 1X, 0,05% SDS coprioggetto tampone di lavaggio di fronte al fondo del piatto. Il coprioggetto cadranno spostando il lato scorrimento a lato.
4. Dopo che il coprioggetto viene rimosso, posizionare il vetrino in un rack con un bagno fresco caldo 1XSSCm 0,05% SDS. Agitare per un paio di minuti
5. Trasferimento diapositive più rack per un bagno di 0,06 X SSC.
6. Trasferimento diapositive ad un altro ba° di 0,06 X SSC contenente un rack fresca, cancellando la diapositiva su un tovagliolo di carta per rimuovere il più SDS-contenente tampone il più possibile prima di mettere nella vasca da bagno fresco.
7. Agitare scivoli per un paio di minuti.
8. Girare subito a temperatura ambiente per 5 min a 700 rpm, poi scivola pronti per la scansione. Conservare al buio fino a scansione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deoxyuridine-5’-triphosphate
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set PCR grade
Random Hexamer primers		Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Post-Labelling Reactive Dye Pack
QIAquick		Qiagen	28104	PCR Purification kit
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Buffer			To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
Phosphate wash buffer	Buffer			For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.
Phosphate elution buffer	Buffer			Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water
Sodium Carbonate Buffer				(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.