Valutazione della funzione cardiaca e Energetica nel Cuori mouse isolato mediante 31 P spettroscopia NMR

Riepilogo

Langendorff-mode perfusione cuore isolato, in collaborazione con ³¹ P spettroscopia NMR, combina i campi della biochimica e fisiologia in un esperimento. Il protocollo consente la misurazione dinamica del fosfato ad alto contenuto energetico e il fatturato nel cuore, mentre contemporaneamente il monitoraggio della funzione fisiologica. Quando eseguito correttamente, questa è una tecnica preziosa nella valutazione di Energetica cardiaco.

Abstract

Modelli murini bioingegneria sono diventati strumenti di ricerca potenti nel determinare relazioni causali tra alterazioni molecolari e modelli di malattie cardiovascolari. Sebbene la biologia molecolare è necessario identificare i cambiamenti chiave nella via di segnalazione, non è un surrogato significato funzionale. Mentre fisiologia può fornire risposte alla domanda di funzione, che combina la fisiologia con la valutazione biochimica di metaboliti nel intatto, cuore pulsante permette un quadro completo della funzione cardiaca ed energetica. Per anni, il nostro laboratorio ha utilizzato perfusione cuore isolato in combinazione con risonanza magnetica nucleare (NMR) per eseguire questa operazione. Funzione ventricolare sinistra viene valutata Langendorff-mode perfusione cuore isolato mentre energetica cardiaca è misurata eseguendo

Protocollo

1. Per questi esperimenti, due sistemi separati sono utilizzati contemporaneamente. Per l'acquisizione di ³¹ spettri P, un magnete Bruker 14T è interfacciato con il III Avance console e un computer dotato di software TopSpin V2.1. Per la valutazione della funzione cardiaca, un sistema personalizzato costruito perfusione cardiaca è interfacciato con il PowerLab 4 / 30 di acquisizione dati, dotato di 6 LabChartPro il software per l'analisi dei dati.
2. Il giorno dell'esperimento, 1 litro di Krebs-Henseleit buffer è preparato come segue: 0,5 mm EDTA, KCl 5,3 mm, 1,2 mm MgSO _4, 118mm NaCl, NaHCO ₃ e 25 mm. La miscela viene poi bollito con 5% di CO ₂ / 95% O ₂ per 10-15 minuti prima dell'aggiunta di 2mM CaCl _2. Infine, i substrati, sotto forma di 10 mM glucosio e piruvato 0,5 mm, vengono aggiunti.
3. Regolazione della temperatura durante l'esperimento è critica. Circolatori riscaldamento vengono utilizzati per mantenere la temperatura tra i 37,0-37,5 ° C, mentre il cuore si trova all'interno del magnete. La temperatura è monitorata per tutta la durata dell'esperimento utilizzando una sonda di temperatura in fibra ottica.
4. Pressione di perfusione e la pressione del ventricolo sinistro sono monitorati tramite trasduttori di pressione collegata ad un sistema di acquisizione dati e visualizzati utilizzando il software incluso. Questi sono tarati con uno sfigmomanometro standard di prima dell'esperimento. Inoltre, le linee di pressione sono lavata in modo adeguato al fine di rimuovere tutte le bolle d'aria.
5. Un campione standard di 150 mM fosfato di sodio (il che è equivalente alla forza ionica del tampone KH) è usato per "calibrare" la sonda prima l'inserimento del cuore. Questo facilita il segnale e diminuisce il tempo necessario per iniziare il periodo di acquisizione, una volta il cuore è posizionato all'interno della sonda.
6. Per ridurre la coagulazione, il mouse viene iniettato con 200 unità di eparina IP Dopo 5 minuti, sodio pentobarbital (175 mg / kg) IP è dato.
7. Il cuore è rapidamente asportato (con i polmoni e timo intatto) e arrestato nel ghiaccio freddo KH buffer.
8. Mentre tenuta in ghiaccio, i polmoni sono rapidamente rimosse. I lobi del timo sono identificati e delicatamente pelati indietro per esporre l'aorta. Il timo è stato rimosso. L'aorta viene poi isolata con cura rimuovere qualsiasi tessuto circostante.
9. Micro pinze sutura vengono utilizzati per tenere delicatamente entrambe le pareti dell'aorta per esporre il lume. L'aorta viene accuratamente posizionato sulla cannula fatto da 0,965 mm esterno tubo di polietilene (PE50). L'aorta viene tenuta in posizione con un morsetto nave micro mentre suture sono rapidamente legato intorno l'aorta. La clip viene rimosso e la pinza sono utilizzati per controllare con attenzione che la cannula è al di sopra della radice aortica. Vincoli aggiuntivi vengono aggiunti se necessario per tenere il cuore a posto.
10. Qualsiasi tessuto in più viene rimossa con pinze e microscissors. Una piccola incisione viene fatta in atrio sinistro. A mm 0,61 diametro esterno tubo di polietilene (PE10) viene accuratamente inserito attraverso l'atrio sinistro, cavità ventricolare sinistra, e attraverso l'apice, mentre delicatamente tenendo il cuore. Il tubo in eccesso viene tagliato.
11. Un sgonfiato pieni d'acqua palloncino viene inserito attraverso l'atrio nel LV e viene tenuto in posizione con del nastro adesivo o suture. La velocità della pompa peristaltica viene gradualmente aumentata per fornire un flusso sufficiente al cuore. Fino a quando il cuore è posto nella la sonda NMR, il cuore continuerà ad essere perfusi con flusso costante pari a circa 2 ml / min. Il palloncino viene gonfiato LV con un piccolo volume, utilizzando una siringa micrometro per verificare che il trasduttore di pressione bassa tensione è in funzione.
12. Il cuore è accuratamente inserito in un tubo NMR 10 mm. Un ampio foro "filatrice" è usato per guidare il tubo nella posizione corretta all'interno della sonda. L'intero apparato è quindi saldamente al "cordone ombelicale" con nastro adesivo.
13. Il cordone ombelicale è lentamente abbassato nel foro superiore del magnete fino a quando il cuore / NMR tubo è all'interno della bobina della sonda 10 mm NMR.
14. Una volta che il cuore è nella posizione corretta all'interno della sonda, il flusso della pompa peristaltica è regolato in modo da raggiungere una pressione di perfusione di 80mmHg. (Ricordate, che fino a questo punto il cuore era perfuso con un flusso costante di circa 2 ml / min). La pressione di perfusione è quindi mantenuto attivando il meccanismo di "hold" sul controller della pompa. Il cuore è poi consentito un periodo di equilibrio di 15-20 minuti. Durante quel periodo, il volume del pallone LV è regolata per ottenere una pressione telediastolica di 8-10 mmHg.
15. Durante il periodo di equilibrio, è necessario ottimizzare i parametri dello spettrometro in modo da ottenere il segnale di fosforo migliore possibile. Questo si ottiene impostando l'impulso radio alla frequenza con cui il nucleo fosforo risuona ("tuning") e rendendo il campo magnetico omogeneo ("shimming").
16. Dopo il periodo di equilibrio, più ³¹ P spettri NMR può essere ottenuto. Il periodo di acquisizione per ogni spettro dipende da tha intensità di campo del magnete, la dimensione del campione, e il rapporto segnale-rumore richiesti da un esperimento specifico. Spettri sono ottenuti utilizzando un magnete 14 Telsa facendo la media del segnale ottenuto da impulsi radio 256 frequenza di 20 ms con un angolo di 60 gradi a fogli mobili e ritardo di 2,0 secondi. Questo esperimento richiede circa 10 min.

Rappresentante Risultati

Dall'hardware di acquisizione dati e il software LabChart, diversi parametri della funzione cardiaca può essere misurata in tutto il protocollo sperimentale. La misura tipica della funzione cardiaca, la pressione sviluppata ventricolare sinistra (LVDevP), si ottiene sottraendo la pressione telediastolica (EDP) dalla pressione sistolica (Figura 1). Questa misura può variare a seconda del ceppo del mouse e la condizione del cuore (cioè, sovraccarico di pressione). Tuttavia, in un normale C57BL6 LVDevP cuore del mouse è in genere tra 100-110 mmHg fisso pressione telediastolica di 8-10 mmHg. Inoltre, il programma permette LabChart per la misurazione della frequenza cardiaca in base alla misurazione ciclico delle onde di pressione LV. Ancora una volta, questa misura può variare, ma i valori tipici sono 350-400 bpm quando i cuori sono autorizzati a battere a tassi intrinseca. Tuttavia, il cuore può essere standardizzato mediante un sistema di stimolazione dove è conservata la frequenza cardiaca a 420 bpm. Inoltre, le misure di contrattilità (+ dP / dt) e rilassamento (-dP/dt) può essere stimato utilizzando la derivata prima l'onda di pressione LV. Durante il protocollo sperimentale è facile valutare il meccanismo di Starling incorporando un rapporto pressione-volume. Questo si ottiene effettuando aumenti graduali nel volume pallone LV e rilevando la LVDevP così come per i disavanzi eccessivi. Questi valori possono essere rappresentati come illustrato nella figura 2. Mentre la curva di Starling è ottimale, notando il volume necessario per ottenere un EDP di 8-10 mmHg, può dare un'idea indiretta della dimensione LV da camera. Questo può essere utilizzato nei modelli di banding aortico come cuore ipertrofico di solito richiedono un volume più piccolo palloncino, mentre i cuori dilatati richiedono un volume maggiore rispetto ai controlli. La tabella 1 mostra i dati rappresentativi funzione cardiaca, acquisite durante il protocollo di perfusione.

Il P ³¹ spettrometro NMR fornirà segnali di fosfocreatina (PCr) e le tre fosfati di ATP (γ-ATP, α-ATP, e β-ATP) e fosfato inorganico (Pi) come mostrato nella Figura 2. Analisi di ciascuno di questi picchi fornisce un valore per l'area sotto la curva. La quantità di ATP è stimato dalla media dei γ-ATP e β-ATP aree. (L'α-ATP non viene utilizzato perché le molecole NAD contribuire ad una parte sconosciuta del segnale totale). Lo stato energetico del cuore è determinato dal rapporto tra la PCR e aree ATP (PCR: il rapporto ATP). Questo valore è tipicamente 1,5-1,7 in un cuore mouse fornito con il glucosio come substrato primario. Anche se ³¹ P NMR non prevede misure dirette di ATP e PCr, l'area dei picchi è proporzionale alla quantità dei composti contenenti fosforo nel campione. I valori per questi segnali possono essere stimati utilizzando altri metodi. Per esempio, le misure dirette di ATP da alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) in una coorte di cuore può produrre una concentrazione media. Questo valore può quindi essere utilizzato per calibrare le superfici medie ATP osservato negli spettri. La concentrazione di PCr può essere calcolata sulla base dell'area PCr relative all'area ATP. E 'anche possibile stimare il pH, analizzando il passaggio relativo chimica del fosfato inorganico (Pi) al segnale PCr. ¹ Usando diverse sequenze di impulsi radio, la creatina chinasi velocità di reazione o la velocità di sintesi di ATP reazione può anche essere misurata ^2.

Tabella 1. Baseline funzione cardiaca da isolate cuori perfusi. LVDevP: pressione ventricolare sinistra sviluppati; LVEDP: ventricolare sinistra telediastolica pressione; HR: frequenza cardiaca; RPP: pressioni sul tasso di prodotto; + dP / dt: prima pressione derivato LV positiva; -dP/dt: prima pressione derivato LV negativo; PP : pressione di perfusione; CF: flusso coronarico.

Figura 1. Rappresentante onde di pressione bassa tensione da un software LabChart Pro.

Figura 2. Curve di Starling Rappresentante di controllo (linea continua) e aortica bande (linee tratteggiate) topi. A) funzione sistolica rappresentata da LVDevP oltre l'aumento dei volumi LV come determinato dal volume del pallone LV. B) la funzione diastolica come rappresentato dalla EDP oltre l'aumento dei volumi LV come determinato dal volume del pallone LV. LVDevP: pressione ventricolare sinistra sviluppati (sistolica meno p diastolicaressure); EDP: pressione telediastolica.

Figura 3. Rappresentante ³¹ P spettri NMR di cuore isolato perfuso del mouse. Si noti il ​​picco relativamente piccolo Pi. In un cuore aerobico perfuse fornito con acidi grassi piruvato o in aggiunta al glucosio, questo picco dovrebbe essere minimo. Durante i periodi di ischemia, questo aumenta di picco, mentre il picco PCr diminuisce. Si noti la spalla destra del picco α-ATP. Questo è il contributo di molecole di NAD. Pi: fosfato inorganico; PCr: fosfocreatina, ATP: adenosintrifosfato.

Discussione

³¹ P spettroscopia NMR nel Langendorff-perfuso cuore del mouse isolato fornisce dati affidabili e riproducibili. ^{3, 4} Tuttavia, è imperativo che cannulazione dell'aorta e l'inserimento del palloncino LV sono fatte correttamente tali da consentire stabile funzioni cardiache mentre all'interno del NMR tubo. In aggiunta, la regolazione della temperatura è fondamentale per ottenere il corretto funzionamento di base. Un fattore importante per ottenere buone, analizzabili spettri NMR è in aumento il rapporto segnale-rumore. Ciò può essere ottenuto facendo in modo ottimale "tuning" e "spessoramento" sul campione. Come accennato nel testo del protocollo, l'uso di un campione standard prima l'inserimento del cuore può facilitare questo. E 'anche utile avere un adeguato imprese "campione". Cuori di peso inferiore a 100 mg in genere forniscono inferiore PCr e segnali ATP così aumenta in tempo di acquisizione sarà necessario per ottenere spettri buona fosforo.

Ci sono diversi modi per modificare l'attuale protocollo di raccogliere ulteriori informazioni riguardanti la funzione cardiaca ed energetica. Nel nostro laboratorio, abbiamo i cuori perfusi con tampone substrato misto che può includere la presenza di diverse combinazioni di acidi grassi (in concentrazioni basse e alte), lattato, chetoni, e l'insulina. Con l'uso di isotopi stabili nel buffer di perfusione (cioè, ¹³ C etichettato substrati), possediamo la capacità di stimare l'utilizzo del substrato per il contributo relativo della etichettati acetil-CoA nel ciclo TCA. ^5-7 Per questa applicazione, eseguiamo isotopomero analisi di ¹³ e ¹³ C3-C4-glutammato con ¹³ C spettroscopia NMR. Ciò richiede freeze-bloccaggio del cuore, alla fine del protocollo di perfusione e di eseguire una estrazione del tessuto congelato. Questo sarà un ulteriore esperimento in quanto l'analisi richiede l'utilizzo di una sonda diversa con parametri di installazione separato. Altre applicazioni includono la sostituzione del glucosio con desossiglucosio nel buffer durante il monitoraggio del tempo-dipendente accumulo di 2-fosfato desossiglucosio nel cuore con ³¹ P spettroscopia NMR. Questo metodo consente la misura del consumo di glucosio del miocardio. ^{7, 8} Inoltre, il nostro laboratorio ha analizzato la funzione cardiaca ed energetica nei protocolli di perfusione costituito da ischemia / riperfusione e sfida elevato carico di lavoro. ^{6, 8-10}

In sintesi, ³¹ P spettroscopia NMR nei cuori del mouse isolato è una procedura tecnicamente impegnativo che richiede l'uso di attrezzature sofisticate. Tuttavia, i dati che produce un valore inestimabile per il ricercatore che desidera analizzare la funzione energetica e dei modelli di topo geneticamente. Per il nostro laboratorio, queste tecniche sono state fondamentali nella nostra comprensione delle conseguenze di una varietà di fattori di stress sulla funzione cardiaca, energetica, e il metabolismo. ^{1, 11, 12}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnesium Sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	Reagent	Sigma-Aldrich	E1644
Potassium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	P4505
Sodium bicarbonate	Reagent	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Calcium chloride dihydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	C5080
D-Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Sodium Pyruvate	Reagent	Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	Equipment	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Equipment	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Equipment	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	Equipment	ADInstruments	ML224
STH Pump Controller	Equipment	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Peristaltic Pump	Equipment	ADInstruments	ML172
Disposable BP Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT0699
10mm NMR Sample Tube	Equipment	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
Polyethylene tubing PE10	Equipment	BD Biosciences	427401
Physiological Pressure Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT844
Polyethylene tubing PE50	Equipment	BD Biosciences	427411
Micrometer syringe	Equipment	Gilmont Instruments	GS-1101
McPherson Forceps	Equipment	Miltex Inc.	18-949
Castraviejo microscissors	Equipment	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptix Signal Conditioner	Equipment	Neoptix, Inc.	Reflex - 1