Lo xenotrapianto di cellule staminali umane in embrioni di pollo

Riepilogo

In questo articolo presentiamo un metodo per il trapianto di cellule staminali umane in varie regioni del sistema nervoso centrale di un embrione di pollo. Ciò fornisce un In vivo per valutare la proliferazione e la differenziazione dei vari tipi di cellule staminali umane negli ambienti di tessuti embrionali.

Abstract

L'embrione di pollo è un classico modello animale per studiare il normale sviluppo embrionale e fetale e per gli esperimenti di xenotrapianto di studiare il comportamento delle cellule in una forma standardizzata

Protocollo

1. Isolamento e la coltura di cellule staminali umane e la preparazione per l'iniezione in embrioni

1. Le cellule staminali umane utilizzate come esempi di questo protocollo (cervello, adiposo, midollo osseo) sono isolati in modo diverso dai diversi tessuti. Per esempio, cellule staminali neurali adulte vengono isolate dai pezzi di tessuto raccolti dalla parete del ventricolo del cervello durante la neurochirurgia endoscopica, che sono poi dissociate alle singole celle che vengono coltivate in vitro. Le cellule staminali neurali formano spontaneamente neurosfere che galleggiano nel mezzo di coltura, mentre altri tipi di cellule aderire al fondo del piatto ^7. Derivate da tessuto adiposo cellule staminali mesenchimali sono ottenuti da materiale liposuzione che è enzimaticamente digerito e tese a rimuovere il tessuto fibroso e poi centrifugato per rimuovere adipociti maturi. Le cellule risultanti sono risospese in terreno di coltura integrato con siero di promuovere la proliferazione delle cellule staminali in altri tipi di cellule staminali emopoietiche e ⁸ cellule progenitrici possono essere isolati da aspirati di midollo osseo da una selezione positiva utilizzando anticorpi specifici coniugati con particelle magnetiche (Myltenyi Biotec, Germania o Dynal-Invitrogen, USA) e la separazione delle cellule magnetiche e / o utilizzando anticorpi coniugati con fluorofori e fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) ^9.
2. Per facilitare la successiva identificazione, etichetta le cellule staminali con un marcatore fluorescente prima dell'impianto in embrioni di pollo. Le cellule staminali possono essere etichettati con coloranti fluorescenti lipofili come DII (Invitrogen, USA) o PKH26 (Sigma, USA) utilizzando protocolli di fornitore-raccomandato fino a poco prima dell'impianto, o, per una etichetta permanente essenzialmente alcun pericolo di cellule ospiti contaminanti, possono essere trasdotte con il gene di una proteina fluorescente come proteina fluorescente verde, utilizzando vettori lentivirali, pur nella cultura ^10.
3. Protocolli per la cultura e la propagazione delle cellule staminali umane possono variare. Protocolli dettagliate sono disponibili in letteratura. Brevemente, una sfera che formano le cellule staminali sono tipicamente coltivate in fiasche, mentre le cellule staminali aderenti sono tipicamente coltivate in piastre di Petri (che facilitano la triturazione quando spacca, vedi sotto), in mezzo adeguato. Per la suddivisione o la raccolta, pellet sfera che formano le cellule del 5 centrifugazione min a 1200rpm e risospendere in pre-riscaldato tripsina / EDTA soluzione per non più di 5 minuti a 37 gradi Celsius. Per le cellule aderenti aggiungere la tripsina / EDTA soluzione alla capsula di Petri, e triturare alla fine di 5 minuti. Terminare il tripsinizzazione con l'aggiunta di Ca ^{2 +} mezzo contenente, a volte completati con l'albumina. Per rimuovere la tripsina / EDTA, centrifugare le cellule (5 min a 1200rpm), rimuovere il surnatante, risospendere in veicolo di iniezione a freddo (in genere medio o PBS), e centrifugare di nuovo (5 min a 1200rpm). Rimuovere la maggior parte di questo supernatante e risospendere delicatamente le cellule per creare una sospensione di cellule altamente concentrato.
4. Mantenere la sospensione di cellule staminali umane in una piccola fiala innevate o provetta da microcentrifuga in ghiaccio per diverse ore prima dell'iniezione. Sopravvivenza in questo stato può essere di tipo cellulare-dipendente. Il veicolo iniezione deve essere ottimizzato in base alle proprietà delle cellule, comprese le loro adesività (ad esempio un basso Ca ^{2 +} veicolo può aiutare a prevenire grumi) e resistenza alle variazioni di ipossia e pH.

2. Uovo di incubazione e di preparazione

1. Conservare le uova fecondate in una camera di raffreddamento (per esempio: Termaks, Bergen, Norvegia) a 14-15 ° C prima dell'incubazione. A questo sviluppo temperatura è arrestato fino a quando inizia l'incubazione. Uova fecondate conservati per più di 10 giorni a temperature più basse hanno un tasso più basso di successivo sviluppo e la sopravvivenza.
2. Rilanciare lo sviluppo, posto le uova in una umidificata, tiraggio forzato incubatore (ad esempio: Binder, New York, USA) a 38-39 ° C, e incubare fino alla fase di sviluppo desiderato è raggiunto (per la stadiazione, vedi rif 11. ).
3. Prima di aprire l'uovo, creare una sacca d'aria sopra l'embrione con l'inserimento di un 18 ago della siringa calibro attraverso il guscio dell'uovo (non troppo in profondità per evitare di forare il tuorlo) e l'evacuazione 4 ml di albumina (Fig. A). Questo crea una caduta di pressione che in pochi minuti è pareggiato con l'entrata di aria attraverso il guscio poroso. Come l'aria entra raccoglie nel punto più alto all'interno del guscio, separando così l'embrione dalla superficie interna del guscio.
4. Sigillare il foro creato dal l'ago della siringa con nastro di plastica convenzionale.

3. Tirare micropipette di vetro

1. Tirare micropipette di vetro con vetro al borosilicato (per esempio, 1,2 OD x 0,94 mm ID, Harvard Apparatus, USA) su un elettrodo estrattore convenzionale (per esempio, modello P-2000, Sutter Instruments, USA). Regolare le impostazioni estrattore di ottenere micropipette che hanno elevata resistenza d'ingresso quando viene utilizzato come Microelectrodes. Suggerimenti dovrebbe essere di circa 1-1,5 cm di lunghezza. Gli alberi possono essere contrassegnati ad intervalli di 1 mm per il calcolo dei volumi espulso.
2. Rompere le punte micropipetta a una dimensione praticabile piegando con una pinza o spingere contro una superficie solida durante la visualizzazione al microscopio. La rottura deve essere il più uniforme possibile in tutto il perimetro del vetro e il diametro interno conseguente alla punta dovrebbe adattarsi alle dimensioni delle cellule per essere utilizzato senza essere ostruiti. Tipicamente di 20-30 micron di diametro interno funziona bene.

4. Preparazione di Fast soluzione colorante verde (reagente di contrasto)

1. Preparare una soluzione allo 0,1% (w / v) di Fast colorante verde (Sigma-Aldrich, USA), sciogliendo in soluzione salina fisiologica di pollo (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 1 mM Na- fosfato, 5 HEPES mM, 11 mM glucosio, pH 7,4).
2. Filtrare la soluzione rapida verde attraverso un micron 0,22 Millex GP filtro (Co. Millipore, Bedford, USA).

5. Aprendo le uova e contrastanti l'embrione

1. Inserire due pezzi di nastro sulla parte superiore dell'uovo, che copre le dimensioni della sacca d'aria. Mantenere l'uovo orientato in modo che l'area registrato (e quindi la camera d'aria) è più alto, tagliare una piccola finestra all'interno dei confini dell'area registrato utilizzando un paio di forbici dissezione robusto. Il nastro aggiunge il supporto e aiuta a prevenire i frammenti cadano sul guscio l'embrione. Le bolle d'aria associata alla sacca d'aria possono essere estratti con il back-end di un puntale di plastica o altri sonda smussato.
2. Disegnare una soluzione rapida verde in una siringa da 1 ml con un ago da 25 gauge. Rimuovere eventuali bolle d'aria nella siringa e l'ago. Piegare l'ago in un angolo di 45 gradi, penetrare in un punto al di fuori della piastra embrionale (identificata con l'anello dei vasi sanguigni che lo circoscrivono, penetranti all'interno della mortalità embrionale aumenta la piastra) e con attenzione guidare il ricamo sotto l'embrione. Iniettare il colorante fino a contrasto desiderata. L'embrione, che normalmente è trasparente, dovrebbe stare fuori come un fantasma biancastro contro il colore verde scuro (Fig. B). Molti ricercatori utilizzano inchiostro di china (diluito al 10% v / v) al posto di Green veloce. In questo caso è importante utilizzare inchiostro di china che non è tossico, come inchiostro Pelikan Fonte India.

6. Fare romboencefalo e del midollo spinale, le lesioni del tubo neurale

1. Produrre aghi affilati tungsteno di fiamma incisione breve (2-3 cm), pezzi di 100 micron di diametro asta di tungsteno (numero di catalogo 719000, A & R Sistemi, Seattle, Washington), con un acetilene / ossigeno torcia. Questo viene fatto inserendo la fine dell'asta molto brevemente in la fiamma fino a quando una scintilla si vede, che rappresenta l'erosione esplosivo degli strati esterni di tungsteno, lasciandosi dietro una punta acuminata.
2. Utilizzando un affilato ago di tungsteno, fendere e deviare la membrana vitellina che copre la zona per microchirurgia.
3. Utilizzando un secondo ago di tungsteno appuntito (la punta dell'ago prima è spesso danneggiato dopo il taglio attraverso la membrana vitellina e non adatto per microchirurgia successive), tagliare con cura attraverso l'epitelio sovrastante il tubo neurale e deviare, poi tagliato intorno e sotto il pezzo del tubo neurale da rimuovere, con tratti brevi e rapidi verso l'alto (Figura C). Fare i tagli trasversali e poi i tagli longitudinali è di solito di maggior successo. Non tagliare troppo in profondità o si rischia di penetrare i vasi sanguigni sottostanti, che in genere è fatale.
4. Capovolgere dolcemente o trascinare il pezzo di tessuto asportato dal sito della lesione utilizzando l'ago di tungsteno. Se questo si rivela difficile, ma può anche essere rimosso mediante aspirazione bocca utilizzando una micropipetta di vetro attaccato al tubo flessibile.

7. Iniezione di cellule staminali umane

a. L'iniezione in una lesione del tubo neurale

Disegnare una piccola quantità di cellule nella punta di una micropipetta di vetro dalla bocca di aspirazione con un tubo di plastica. La concentrazione di lavoro della sospensione cellulare deve essere ottimizzato per il tipo di cellule da iniettare. Montare la micropipetta su un micromanipolatore e collegarlo ad una pompa microinjector (ad esempio: PV830 PicoPump pneumatico, WPI, Washington, USA). Sotto controllo visivo utilizzando un microscopio dissezione, guida la punta micropipetta nella lesione ed espellere attentamente le cellule, aumentando la pressione dell'aria (sia da impulsi di pressione costante o per dilagare gradualmente la pressione) (Figura C). Quando la quantità desiderata di cellule si deposita all'interno del sito della lesione, con attenzione ritirare la micropipetta.

b. Iniezione nel lume del tubo neurale

In alcuni casi può essere desiderabile per iniettare le cellule nei ventricoli sviluppo cerebrale, per esempio se le cellule sono invasivi sufficienti per accedere al tessuto nervoso, in assenza di lesioni. L'iniezione di cellule nel lume di brain regione richiede l'utilizzo di una fase di sviluppo in cui il lume fornisce un recipiente abbastanza grande, ed è facilmente raggiungibile; fasi HH 12-18 sono favorevoli a questo proposito. Una lesione non è necessario. Basta forare la parete del tubo neurale con la micropipetta di vetro prima dell'iniezione di cellule. Gli elementi chiave per il successo di questo metodo sono la nitidezza della micropipetta e la repentinità della penetrazione, troppo lento il movimento e la punta micropipetta può fossetta la parete del tubo neurale senza penetrare.

c. Iniezione sistemica

Iniezioni sistemica può essere effettuato tramite l'extra-embrionali vasi sanguigni (a partire dalla fase HH 15, quando i pescherecci ben sviluppate). Questo non è raramente accompagnata da alcuni sanguinamento e poiché ci sono molte piccole arterie e vene meno grandi, iniezioni intra-arteriosa sono generalmente più sicuri quando si tratta di sopravvivenza dell'embrione. D'altra parte, le iniezioni endovenose di fornire un accesso più rapido delle cellule al cuore e quindi probabilmente una distribuzione più uniforme delle celle. Una iniezione di successo richiede una micropipetta tagliente con un diametro più piccolo del vaso bersaglio. Approccio della nave lungo il suo asse in un piccolo angolo rispetto al piano orizzontale (circa 30 gradi). Spingere la micropipetta nei confronti della nave fino a quando la nave inizia ad occludere. Quindi spingere ulteriormente in un movimento deciso, brusco da penetrare. Ritrarre lentamente fino a quando il sangue è visto di disegnare per azione capillare nella punta della micropipetta. L'iniezione di cellule dovrebbero poi essere eseguiti usando una pressione costante, dopo di che la micropipetta è ritratta con un movimento rapido.

8. Tenuta l'uovo

1. Dopo l'iniezione, lasciate l'uovo stare fermo per alcuni minuti per consentire le cellule iniettate di stabilirsi e di aderire. Per evitare la disidratazione (che può verificarsi rapidamente e può risultare fatale), giaceva un pezzo di tessuto inumidito o carta da filtro sopra la finestra durante questo periodo di riposo.
2. Dopo pochi minuti e le cellule si sono stabiliti, a secco il guscio attorno alla finestra e sigillare la finestra con nastro di plastica convenzionale. Assicurarsi che questo sigillo è stretto e che non albumina può fuoriuscire attraverso l'apertura o tra il serbatoio e il nastro (questo si rivela spesso fatale durante l'incubazione successive).
3. Sostituire le uova per la ventilazione forzata incubatore per un ulteriore sviluppo. L'osservazione può essere fatta ad intervalli rimuovendo il nastro sopra la finestra.

9. Embrione dissezione

1. Una volta che l'embrione ha raggiunto la fase desiderata, crack aprire l'uovo in una ciotola di ghiaccio freddo soluzione fisiologica o PBS (il nastro che copre la finestra deve essere tagliato prima a permettere le due metà del guscio d'uovo per separare). Il ghiaccio-freddo salina serve per anestetizzare il bimbo con l'ipotermia. Il cuore deve rapidamente rallentare e fermarsi in un paio di minuti.
2. Separare l'embrione dalle membrane extraembrionali e lo stadio lo si utilizza rif. 11.
3. Decapitare l'embrione, il trasferimento ad un piatto dissezione che ha un pavimento in gomma di silicone e soluzione fisiologica ossigenata contiene integrato con glucosio (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 1 mM Na-fosfato, 5 HEPES mM, 11 mM glucosio, pH 7,4) e il pin è veloce lato ventrale in su. Rimuovere i visceri addominali e toracici. Utilizzando un forbici angolato, fare incisioni longitudinali lungo ogni aspetto ventrolaterale della colonna vertebrale. Soprattutto nelle fasi successive (dopo giorno 6 di sviluppo), l'incisione iniziale è meglio del made in regione lombo-sacrale in cui lo spazio tra le vertebre e il midollo spinale è maggiore. Rimuovere l'aspetto ventrale della colonna vertebrale per rivelare il midollo spinale. Assicurarsi che la soluzione fisiologica rimane ossigenata dalle bolle a circa 10 minuti con intervalli di puro ossigeno medicale.
4. Accuratamente tagliato le radici dorsali e ventrali nascente su entrambi i lati, transetto il midollo spinale a livello desiderato, e delicatamente sollevarlo fuori dal canale vertebrale. Il midollo spinale sopravviverà per molte ore in questo stato e può essere sottoposto a ¹² anatomiche e fisiologiche ^13,14 esperimenti.

Figura 1. A) L'approccio giusto per l'evacuazione di albumina. Notare la posizione dell'embrione e il posizionamento dell'ago. B) In contrasto dell'embrione. Notare il punto di penetrazione dell'ago al di fuori del disco embrionale. C) Rappresentazione schematica della procedura di lesione spinale unilaterale del tubo neurale seguita da trapianto di cellule.

Discussione

L'embrione di pollo è un modello animale comodo e versatile per gli esperimenti di xenotrapianto. La mancanza di un funzionale sistema immunitario durante lo sviluppo embrionale e fetale permette la sopravvivenza e lo sviluppo delle cellule di qualsiasi specie che tollera la temperatura di incubazione. Embrioni di pollo sono stati utilizzati per testare il potenziale rigenerativo di vari tipi di cellule staminali (recensione in rif. 15). Le cellule staminali dei mammiferi in grado di integrare nei tessuti embrionali di pollo compreso il sistema nervoso centrale, dove possono dare origine ai neuroni la cui assonale proiezioni, connettività sinaptica e le proprietà elettrofisiologiche possono essere valutate nel contesto funzionale di ^1,2 circuiti neurali.

Perché le procedure chirurgiche sono relativamente facili, e le iniezioni sono fatte sotto visive al posto di controllo stereotassico, il numero di embrioni può essere facilmente aumentata a ospitare diverse condizioni sperimentali all'interno di un singolo esperimento. Tipicamente le cellule possono essere iniettato in 20-30 embrioni nell'ambito di un esperimento di 4 ore. Il post-iniezione di mortalità degli embrioni è il principale fattore limitante. Devono essere prese precauzioni per evitare emorragie e disidratazione. Siate consapevoli che ci sono alcune fasi critiche di sviluppo in cui il tasso di mortalità naturale aumenta. Completa l'embrione con pochi ml di caldo, l'iniezione di pollo sterilizzato suoneria seguito e il giorno prima critica fasi di sviluppo, oltre ad assicurare che la finestra nell'uovo è ben chiusi e ben orientata a evitare perdite, migliora la sopravvivenza. Se la perdita attraverso il nastro di sigillo dovesse accadere, rimuovere il nastro, asciugare le superfici e ri-nastro. Alcuni ricercatori uso cera e vetro o plastica coprioggetto per sigillare la finestra. La mortalità non dovrebbe essere sostanzialmente diversi in iniettato contro sham-operati embrioni.

Anche se ci siamo concentrati qui l'iniezione di cellule staminali umane nel anlage del cervello e del midollo spinale, le cellule staminali possono essere iniettate nel anlage di altri organi (vedi per esempio rif. 4). Ogni organo pone le proprie sfide. Per esempio, l'iniezione nel cuore può essere difficile a causa della elevata resistenza meccanica alla penetrazione e pipetta a causa di movimenti, che invece può essere rallentata da un raffreddamento degli embrioni a temperatura ambiente prima dell'iniezione. Organi che mancano di un lume non può accogliere l'iniezione di volumi sufficienti e possono quindi richiedere lesione chirurgica per creare un recipiente. Nella nostra esperienza, post-lesione rigenerazione dei tessuti è un vantaggio perché promuove l'integrazione delle cellule staminali umane nel tessuto. Le cellule possono anche essere iniettato nel mesenchima embrionale come il mesenchima disperdere somitic o la cresta neurale migrazione come un modo per raggiungere l'incorporazione in derivati ​​mesenchimali, tra cui cresta neurale derivata gangli periferici ^16,17.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescent microscope	Microscope	Olympus Corporation
Stereo Investigator	Program	MBF Bioscience
MIP-GFP mice	Mice	Jackson Laboratory
Mathematica	Program	Wolfram
Image J	Program	National Institutes of Health
Slidebook	Program	Olympus Corporation